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糖酵解过程及中的重要酶类及其调控(二) - 知乎
糖酵解过程及中的重要酶类及其调控(二) - 知乎首发于生化杂谈切换模式写文章登录/注册糖酵解过程及中的重要酶类及其调控(二)lcy19712018关注生化领域催化糖酵解第六步的酶是3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是巯基酶,所以碘乙酸是其不可逆抑制剂。NAD之间有负协同效应,当NAD+不足时可以保证酵解仍可进行,而当NAD+过多时也不会过度反应造成酸中毒。GAPDH及其活性中心,引自PDB-101反应可分为两部分,放能的氧化反应偶联推动吸能的磷酸化反应。砷酸盐与磷酸竞争,可产生3-磷酸甘油酸,但没有磷酸化,是解偶联剂。ATP和磷酸肌酸是GAPDH的非竞争抑制剂。肌肉收缩开始后,磷酸肌酸浓度迅速下降,使酶活升高。但随着乳酸的积累,ATP的抑制增强,酶活下降。GAPDH属于管家基因,表达量相对恒定,在检测基因表达时经常用作内参。但在细胞分化等过程中,其表达量也是会发生改变的,并非一直适用。第八步的变位反应由磷酸甘油酸变位酶催化。2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)是其辅因子,机理是2,3-DPG的3位磷酸转移到底物的2位。磷酸甘油酸变位机制除了辅助变位以外,2,3-DPG还可以调节血红蛋白的携氧能力。2,3-DPG特异性地与去氧血红蛋白结合,并形成盐键稳定构象,降低了血红蛋白对氧的亲和力,从而增加在组织中的氧释放量。而在氧分压较高的肺泡,血红蛋白主要以氧合形式存在,所以对氧的亲和力不变。红细胞中大约有15-50%的1,3-DPG被转化为2,3-DPG,以调节运氧能力。DPG(箭头处)可以与脱氧血红蛋白结合2,3-DPG是一个有趣的例子,表明一些代谢中间物可能具有额外的作用。生化书中有一些ATP、乙酰辅酶A等分子作为别构效应物或酶抑制剂的例子。但其实代谢物的功能比这复杂得多,有许多代谢物会“跨界”到其它领域发挥作用。糖酵解过程中就有几个这样的代谢物。例如有研究发现,FBP通过减弱RANKL诱导的NF-κB/ NFATc-1来抑制破骨细胞生成(Inflamm Res. 2019);还有研究表明,甘油醛-3-磷酸可以修饰α-突触核蛋白,防止其产生淀粉样结构,从而防止帕金森症等神经退行性疾病(Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2019 )。拟南芥中糖和能量感受信号通路,引自Arabidopsis Book. 2008不仅代谢物,酶的功能也可以是复杂多样的。植物中的己糖激酶1(HXK1)可以进入细胞核,作为葡萄糖感受器(Arabidopsis Book. 2008)。更加多功能的是GAPDH。GAPDH不仅可以进入细胞核,还能进入线粒体及多种膜结构,并可以与细胞骨架相互作用。GAPDH的非糖酵解功能包括细胞死亡、自噬、DNA修复、tRNA出核、膜融合和运输、细胞骨架动力学等等,病理上则与癌症和神经退行性疾病等相关。GAPDH的非糖酵解作用,引自Int J Mol Sci. 2019所以说,生物体是复杂的。我在《代谢与代谢途径》一文中给出一张图片,说代谢网络是复杂的。其实,那张图里的每一条代谢途径都是简化的,甚至是残缺的,细胞中实际的代谢情况要复杂得多。这就像,在启动基因组计划的时候很多人以为很快可以攻克癌症,结果却发现还差得远。好在,这本身就是一个进步。而且,我们一直在努力前行。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)控制酵解出口,也是一个关键酶,受到多种调控。PK也是别构酶,可被1,6-二磷酸果糖(FBP)激活,被脂肪酸、乙酰辅酶A、ATP和丙氨酸抑制。其表达受激素影响,胰岛素可增加其合成。PK的变构,引自PDB-101PK有三种同工酶,像HK和PFK一样,各有不同的组织分布和调控方式。L型存在于肝脏中,被二磷酸果糖激活,被脂肪酸、乙酰辅酶A、ATP和丙氨酸抑制;A型存在于脂肪、肾和红细胞,被二磷酸果糖激活,ATP和丙氨酸抑制;M型存在于肌肉中,被磷酸肌酸抑制。参考文献:L Wilches-Buitrago, et al. Fructose 1,6-bisphosphate inhibits osteoclastogenesis by attenuating RANKL-induced NF-κB/NFATc-1. Inflamm Res. 2019 May;68(5):415-421.Kseniya Barinova, et al. Modification by glyceraldehyde-3-phosphate prevents amyloid transformation of alpha-synuclein. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2019 Apr;1867(4):396-404.Matthew Ramon, et al. Sugar sensing and signaling. Arabidopsis Book. 2008;6:e0117.Giovanna Butera, et al. Regulation of Autophagy by Nuclear GAPDH and Its Aggregates in Cancer and Neurodegenerative Disorders. Int J Mol Sci. 2019 Apr 26;20(9):2062.Maria-Armineh Tossounian, et al. The Writers, Readers, and Erasers in Redox Regulation of GAPDH. Antioxidants (Basel). 2020 Dec; 9(12): 1288.编辑于 2022-04-06 14:06生物学糖酵解途径生物化学赞同 312 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录生化杂谈生化教学科研过程中的一些思
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酶_百度百科 网页新闻贴吧知道网盘图片视频地图文库资讯采购百科百度首页登录注册进入词条全站搜索帮助首页秒懂百科特色百科知识专题加入百科百科团队权威合作下载百科APP个人中心丙酮酸激酶播报讨论上传视频是糖酵解过程中的主要限速酶之一收藏查看我的收藏0有用+10本词条缺少概述图,补充相关内容使词条更完整,还能快速升级,赶紧来编辑吧!丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK),别名丙酮酸磷转称酶、磷酸丙酮酸激酶,其分子质量为:228kDa。在糖酵解系统里,它是催化形成第二个ATP反应的酶。能以磷酸烯醇(phosphoenolpyruv- ate)丙酮酸和ADP生成丙酮酸和ATP·ΔGo1=-7.5kcal。除需要二价金属离子外(Mg2+和Mn2+)外,还需要一价金属离子(K+.Rb+,Cs+),在生理上起作用的大概是K+。分子量约25万。是催化ADP为ATP的形成,结果是形成丙酮酸的终产物。中文名丙酮酸激酶 [1]外文名Kinase(phosphorylating), pyruvate别 名丙酮酸磷转称酶;磷酸丙酮酸激酶;丙酮酸-2-O-磷酸转移酶分子量226.232 [1]CAS登录号9001-59-6 [1]目录1作用2正常值3临床意义作用播报编辑丙酮酸激酶使磷酸烯醇式丙酮酸和ADP变为ATP和丙酮酸,是糖酵解过程中的主要限速酶之一,有M型和L型两种同工酶,M型又有M1及M2亚型。M1分布于心肌、骨骼肌和脑组织;M2分布于脑及肝脏等组织。L型同工酶主要存在于肝、肾及红细胞内。心肌细胞坏死后,PK释放入血,PK的测定可用于诊断心肌梗死。正常值播报编辑血清(28.3±12.8)U/L(丙酮酸激酶法)。临床意义播报编辑(1)急性心肌梗死发病后2h PK活性开始升高,22~24h PK活性达高峰(为对照值3倍),第2天达峰值(为对照值的4倍);48~72h后逐渐恢复正常。血清PK活性升高对急性心肌梗死的特异性较高。此外,由于急性心肌梗死后PK活性开始升高和恢复正常均较早,因此可用于急性心肌梗死延展或再梗死的诊断。但有人认为PK不如CK敏感,但是比CK特异,由于升高时间短暂,最好辅之以其他监测指标;也有人认为PK是诊断急性心肌梗死的简便、迅速而可靠的一项指标。(2)宫颈癌、淋巴肉瘤、髓性白血病和霍奇金氏病病人血清PK总活性明显增高。(3)肌原性疾病(假肥大型肌营养不良、Becker型肌营养不良、肢带型以及面肩肱型肌营养不良)的病人,其血清PK活性明显升高,达对照值的1~25倍,阳性率大于90%。相反,在神经源性疾病(脊髓性肌萎缩、肌萎缩侧束硬变等)的患者,大多数人的血清PK活性正常。故测定血清PK活性对于区别肌源性或神经源性肌病有一定的价值。(4)血液系统疾病:先天性非球形细胞溶血性贫血的患者红细胞中PK总活性显着降低。在其他一些血液病如急性白血病、红细胞性白血病、再生障碍性贫血治疗无效性贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、先天性发育不全性贫血等,红细胞PK活性可降低至对照值的50%。新手上路成长任务编辑入门编辑规则本人编辑我有疑问内容质疑在线客服官方贴吧意见反馈投诉建议举报不良信息未通过词条申诉投诉侵权信息封禁查询与解封©2024 Baidu 使用百度前必读 | 百科协议 | 隐私政策 | 百度百科合作平台 | 京ICP证030173号 京公网安备110000020000Nature Communications丨丙酮酸激酶 M2 的代谢功能调节中性粒细胞活性氧的产生和微生物杀灭 - 知乎
Nature Communications丨丙酮酸激酶 M2 的代谢功能调节中性粒细胞活性氧的产生和微生物杀灭 - 知乎切换模式写文章登录/注册Nature Communications丨丙酮酸激酶 M2 的代谢功能调节中性粒细胞活性氧的产生和微生物杀灭Cutew医生Chestnut Studying 摘要Neutrophils rely predominantly on glycolytic metabolism for their biological functions, including reactive oxygen species (ROS) production. Although pyruvate kinase M2 (PKM2) is a glycolytic enzyme known to be involved in metabolic reprogramming and gene transcription in many immune cell types, its role in neutrophils remains poorly understood. Here, we report that PKM2 regulates ROS production and microbial killing by neutrophils. Zymosan-activated neutrophils showed increased cytoplasmic expression of PKM2. Pharmacological inhibition or genetic deficiency of PKM2 in neutrophils reduced ROS production andStaphylococcus aureuskilling in vitro. In addition, this also resulted in phosphoenolpyruvate (PEP) accumulation and decreased dihydroxyacetone phosphate (DHAP) production, which is required for de novo synthesis of diacylglycerol (DAG) from glycolysis. In vivo, PKM2 deficiency in myeloid cells impaired the control of infection withStaphylococcus aureus. Our results fill the gap in the current knowledge of the importance of lower glycolysis for ROS production in neutrophils, highlighting the role of PKM2 in regulating the DHAP and DAG synthesisto promote ROS production in neutrophils.中性粒细胞主要依靠糖酵解代谢来实现其生物学功能,包括活性氧(ROS)的产生。尽管丙酮酸激酶 M2 (PKM2) 是一种糖酵解酶,已知参与许多免疫细胞类型的代谢重编程和基因转录,但其在中性粒细胞中的作用仍知之甚少。在这里,我们报告 PKM2 调节中性粒细胞的 ROS 产生和微生物杀灭。酵母聚糖激活的中性粒细胞显示 PKM2 的细胞质表达增加。中性粒细胞中 PKM2 的药理学抑制或遗传缺陷减少了 ROS 的产生和体外金黄色葡萄球菌的杀灭。此外,这还导致磷酸烯醇丙酮酸(PEP)积累和磷酸二羟丙酮(DHAP)产量减少,而磷酸二羟丙酮(DHAP)是糖酵解从头合成二酰甘油(DAG)所必需的。在体内,骨髓细胞中的 PKM2 缺陷损害了对金黄色葡萄球菌感染的控制。我们的结果填补了目前关于低糖酵解对于中性粒细胞中ROS产生的重要性的认识空白,强调了PKM2在调节DHAP和DAG合成以促进中性粒细胞中ROS产生中的作用。实验结果1活化中性粒细胞胞质中 PKM2 表达增加 作者最初通过分析免疫基因组计划的数据来比较小鼠中性粒细胞和其他骨髓细胞之间的 Pkm2 表达。作者发现,与巨噬细胞(MØ)、嗜碱性粒细胞(BØ)或嗜酸性粒细胞(EØ)相比,中性粒细胞(NØ)中的Pkm2表达更高(图1a)。此外,作者发现巯基乙酸引发的腹膜中性粒细胞表达的Pkm2含量高于骨髓(BM)中性粒细胞,表明激活的中性粒细胞中Pkm2表达增加(图1a)。为了研究 PKM2 蛋白表达模式,分别从 Pkm2fl/fl 和 Pkm2ΔLyz2 小鼠的骨髓中分离出野生型和 PKM2 缺陷型中性粒细胞,然后用血清调理酵母聚糖(Zy/ op) 6 h。作者发现 PKM2 在对照 (Ctrl) 中性粒细胞中组成型表达,并在用 Zy/op 激活中性粒细胞时增加(图 1b)。值得注意的是,PKM2 缺陷的中性粒细胞显示出非常低水平的 PKM2 蛋白表达(图 1b)。 PKM2 以单体、二聚体和四聚体等不同构象存在。稳定的四聚体形式具有高糖酵解活性,可将 PEP 转化为丙酮酸,并且位于细胞质中。二聚体形式具有低糖酵解活性,但可以易位到细胞核中,充当调节基因表达的核转录共激活剂。作者发现Zy/op激活的中性粒细胞中PKM2四聚体形式增加,但PKM2二聚体形式没有增加(图1c)。因此,使用共聚焦显微镜,作者发现PKM2主要位于中性粒细胞的细胞质中(图1d)。作者还评估了人中性粒细胞中的 PKM2 表达。从三名健康受试者的血液中分离出中性粒细胞,并用 Zy/op 激活。与在小鼠中性粒细胞中观察到的数据一致,人中性粒细胞也显示出 PKM2 的组成型基础表达,当用 Zy/op 激活中性粒细胞 6 小时时表达增加(图 1e)。此外,共聚焦分析显示PKM2也主要表达于人中性粒细胞的细胞质中(图1f)。这些结果共同表明 PKM2 表达在 Zy/op 激活的中性粒细胞中上调,并且主要位于细胞质中。实验结果2PKM2 是中性粒细胞产生 ROS 和杀伤能力所必需的 然后作者进行了一系列实验来评估 PKM2 在中性粒细胞功能中的作用。作者首先进行流式细胞术分析来评估用 Zy/op-FITC 激活的野生型和 PKM2 缺陷型中性粒细胞的吞噬作用。作者发现PKM2不影响中性粒细胞的吞噬活性,因为携带Zy/op-FITC的中性粒细胞的百分比和吞噬的Zy/op-FITC的量在野生型和PKM2缺陷的中性粒细胞之间相似(图2a)。此外,PKM2 缺陷的中性粒细胞产生的中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 也没有差异。接下来作者评估了实时 ROS 生成。当用 Zy/op 激活时,PKM2 缺陷的中性粒细胞产生的总 ROS 和超氧化物量低于野生型中性粒细胞(图 2b)。一致的是,当 PKM2 缺陷的中性粒细胞暴露于金黄色葡萄球菌(S. aureus)时,ROS 的产生也会受到损害(图 2c)。 ROS 是中性粒细胞杀菌活性的重要工具。因此,作者接下来确定了暴露于金黄色葡萄球菌的中性粒细胞的杀伤活性,并发现其在PKM2缺陷的中性粒细胞中受损(图2d)。为了扩展 PKM2 对人类中性粒细胞作用的评估,作者从四名健康受试者的血液中分离了细胞,并用草酸盐(一种非选择性丙酮酸激酶活性抑制剂)对它们进行预处理 1 小时,然后用 Zy/op 激活 。作者使用草酸盐是因为没有 PKM2 酶活性的选择性抑制剂。作者还用 TEPP-46 预处理人类中性粒细胞,TEPP-46 激活四聚体形式的 PKM2,维持 PKM2 的糖酵解途径并削弱其向细胞核的迁移。用草酸盐抑制 PK 会减少 ROS 的产生(图 2e)。相反,用 TEPP-46 激活 PKM2 会增加 ROS 的产生,尽管这种效果因每个受试者而异(图 2f)。因此,人中性粒细胞的杀伤活性被草酸盐削弱,并被TEPP-46增强(图2g)。 除了中性粒细胞之外,巨噬细胞也是重要的吞噬细胞,可以产生ROS并有助于杀死细菌。为了验证作者在中性粒细胞中的发现是否也可以扩展到巨噬细胞,作者用Zy/op或金黄色葡萄球菌激活了PKM2缺陷的骨髓源性巨噬细胞(BMDM) )。与中性粒细胞类似,PKM2 缺乏并不影响 BMDM 的吞噬作用。然而,BMDM 中 ROS 的产生实际上略有增加。尽管如此,PKM2 缺陷的 BMDM 的杀伤能力没有差异。因此,PKM2 调节 ROS 的产生,从而杀死中性粒细胞的活性,但不影响巨噬细胞的活性。实验结果3有氧糖酵解对于中性粒细胞中 ROS 的产生至关重要 NADPH 氧化酶复合物催化超氧化物的产生,超氧化物是中性粒细胞中 ROS 的主要来源,这一过程需要大量的 NADPH。在促进 NADPH 产生的不同途径中,PPP 的激活对于触发中性粒细胞的氧化爆发至关重要。由于在没有葡萄糖的情况下,小鼠和人类中性粒细胞的 ROS 产生受到损害,作者接下来评估了糖酵解活性和 ROS 产生之间的关系。为此,作者使用两种同时测定进行了动力学实验,即通过化学发光产生ROS,并使用Seahorse XF96分析仪(安捷伦科技)进行糖酵解应激测试,将结果绘制在同一张图中进行比较(图3a)。在开始测定之前,用 Zy/op 刺激无葡萄糖培养基中的鼠中性粒细胞。对于这两种测定,在开始后18分钟添加葡萄糖。36分钟时,分别添加鱼藤酮和抗霉素A(Rot/AA)、复合物I和复合物III抑制剂以关闭线粒体呼吸;并且,在54分钟时,添加2-DG以抑制糖酵解。图3b显示了ECAR(细胞外酸化率,蓝线)和ROS产生(黑线)。作者发现,在没有葡萄糖的情况下,Zy/op 无法增加 ECAR 或 ROS 的产生。有趣的是,添加葡萄糖增加了 ECAR,而 Rot/AA 没有影响,而 2-DG 将 ECAR 降低至基础水平(蓝线)(图 3b)。同时,作者观察到,当添加葡萄糖时,ROS 产生增加,而添加 Rot/AA 时,ROS 产生略有减少,但当添加 2-DG 时,ROS 产生完全消除。总之,这些结果表明糖酵解代谢对于活化的中性粒细胞产生 ROS 至关重要。由于活化的中性粒细胞增加耗氧量以产生ROS,作者接下来评估了OCR(耗氧率)、葡萄糖代谢和ROS产生之间的相关性(图3c)。如红线所示,在没有葡萄糖的情况下,Zy/op 无法增加 OCR;然而,添加葡萄糖时 OCR 增加,添加 Rot/AA 时 OCR 略有下降,添加 2-DG 后恢复至基础水平。与 ROS 结果(黑线)一起,这突显出虽然部分耗氧量和 ROS 产生是由于线粒体呼吸,但耗氧量和 ROS 产生都依赖于糖酵解。 然后,作者针对糖酵解途径的不同步骤进行了一组实验,以阐明每个步骤对于调节 ROS 产生的重要性(图 3d)。首先,用 PPP 抑制剂 6-AN(6-氨基烟酰胺)处理野生型和 PKM2 缺陷型中性粒细胞。作者观察到,虽然 PKM2 缺陷部分减少了 ROS 产生,但无论 PKM2 是否存在,6-AN 处理都会导致 ROS 产生严重受损(图 3e),这凸显了 PPP 对于这一功能的众所周知的重要性。为了进一步探讨PKM2缺陷是否会损害PPP激活,从而导致ROS产生减少,作者评估了Zy/op激活的中性粒细胞中的NADPH和NADP浓度,但没有发现差异(图3f)。然后作者检查了一些 NADPH 氧化酶亚基的表达。野生型和PKM2缺陷型中性粒细胞之间的gp91-phox基因表达或gp91-phox和p47-phox蛋白表达没有差异(图3g,h)。研究表明,活化的中性粒细胞会增加谷胱甘肽的周转率,而谷胱甘肽在产生 ROS 时可能会被消耗。谷胱甘肽是一种高浓度存在于中性粒细胞中的抗氧化剂分子,其还原形式 (GSH) 和氧化形式 (GSSG) 之间的比率可用于测量细胞内氧化平衡。然而,PKM2 缺乏并没有改变中性粒细胞中总谷胱甘肽的浓度或 GSH/GSSG 比率。其次,作者用 2-DG 抑制己糖激酶 (HK),用 3PO 抑制 PFKFB3,用草酸抑制 PK,处理小鼠和人类中性粒细胞,剂量显示出对乳酸产生的抑制作用相当。如图 3i 所示,抑制 HK、PFKFB3 或 PK 的糖酵解会减少 ROS 的产生。总而言之,这些结果表明不同的糖酵解步骤对于 ROS 的产生很重要;然而,PKM2 通过独立于 PPP 的机制调节 ROS 的产生。 除了依赖于糖酵解之外,ROS 的产生还依赖于 PLC 激活,这会导致钙释放、DAG 产生,从而导致 PKC 激活。作者进行了两项实验,以更好地了解 PLC 依赖性途径和葡萄糖依赖性途径在 ROS 产生中的作用。在第一个实验中,野生型和 PKM2 缺陷型中性粒细胞在用 Zy/op 刺激之前用 PLC 抑制剂 (iPLC) 预处理 1 小时。PLC抑制降低了两种细胞中ROS的产生,但在PKM2缺陷的中性粒细胞中具有累加效应(图3j),表明PKM2独立于PLC调节ROS的产生。在第二个实验中,用 Zy/op 激活小鼠或人类中性粒细胞,而无需葡萄糖(图 3k)。30分钟后,将葡萄糖添加到培养基中,观察到ROS产量增加。30 分钟后,作者添加载体(黑线)、3PO(蓝线)或 iPLC(红线),发现两种抑制剂都能减少 ROS 的产生,表明这两种途径对此功能都很重要。最后,30 分钟后,作者添加了载体(黑线)、iPLC(蓝线)或 3PO(红线),发现在这两种情况下,ROS 产生均降至基础水平,表明 PLC 依赖性和葡萄糖依赖性途径 ROS 生产相互补充。总之,这些结果表明 PKM2 介导的糖酵解和 PLC 途径对于激活的中性粒细胞中 ROS 的产生是独立需要的。实验结果4PKM2 的代谢活性调节中性粒细胞中 ROS 的产生 由于 PKM2 作为转录共激活因子,据报道在糖酵解基因的表达和糖酵解通量的诱导中具有重要作用,因此作者接下来研究了 PKM2 缺陷是否影响葡萄糖转运蛋白 1 (GLUT1) 的表达或葡萄糖摄取。正如预期的那样,作者发现与对照中性粒细胞相比,Zy/op 激活的中性粒细胞中 GLUT1 表达(图 4a)和葡萄糖摄取(图 4b)上调。然而,PKM2 缺乏并不影响这些参数(图 4a、b)。然后,作者评估了总丙酮酸激酶活性(包括 PKM1 和 PKM2),发现用 Zy/op 激活的 PKM2 缺陷型中性粒细胞显着减少(图 4c)。与此一致,与 PKM2 缺陷的中性粒细胞相比,Zy/op 激活的对照中性粒细胞显示丙酮酸(图 4d)和乳酸(图 4e)的产生增加。与此一致,草酸盐处理的人中性粒细胞显示出乳酸产量减少(图4e)。尽管PKM2缺陷的中性粒细胞中线粒体ROS的产生增加,但根据MitoTracker Green和Red的评估,在这些细胞中没有观察到线粒体功能障碍。总而言之,这些结果表明 PKM2 是激活中性粒细胞中典型代谢功能(丙酮酸激酶活性)而不是转录控制活性所必需的。 为了进一步探索 PKM2 调节的代谢变化,作者通过 13C-葡萄糖追踪研究测量了中性粒细胞激活过程中葡萄糖代谢通量的重新分布。Zy/op 激活的野生型中性粒细胞显示糖酵解代谢物增加,包括 G6P、F1,6BP、丙酮酸和乳酸,与糖酵解途径的激活一致。重要的是,DHAP 和 G3P(从葡萄糖从头合成 DAG 的前体)也增加了(图 4f)。然后作者评估了 PKM2 缺陷型中性粒细胞中的葡萄糖代谢通量,发现与野生型中性粒细胞一样,用 Zy/op 激活的 PKM2 缺陷型中性粒细胞中 F1,6BP 的产生也增加。然而,除了 DHAP 和 G3P 之外,丙酮酸和乳酸均下降(图 4f)。重要的是,PEP 在 PKM2 缺陷的中性粒细胞中大量积累。为了更好地了解中性粒细胞中糖酵解通量的方向(即是否有利于乳酸或 DAG 产生),作者评估了 Zy/op 激活的鼠中性粒细胞中的 GAP 和 DHAP 浓度。两种代谢物均得到增强,证实这两种途径在中性粒细胞激活过程中均被激活。此外,作者发现当 PKM2 被草酸盐抑制时,GAP 会积累,并且 DHAP 的产生会受到损害。这些数据表明 PKM2 活性调节 DHAP 途径,导致从葡萄糖从头合成 DAG。实验结果5磷酸烯醇丙酮酸积累减少中性粒细胞中 ROS 的产生 为了阐明从葡萄糖产生 DAG 的 DHAP 途径对于 ROS 产生是否重要,作者用 5-十五烷基间苯二酚 (5-PDR)(一种 3-磷酸甘油脱氢酶 (GDP) 抑制剂)或普萘洛尔预处理小鼠中性粒细胞 ,一种磷脂酸磷酸水解酶抑制剂(图5a)。作者发现这两种抑制剂都会损害 Zy/op 激活的中性粒细胞中 ROS 的产生(图 5b)。这些结果与葡萄糖示踪分析一起表明,PKM2 缺乏或抑制可以通过下调 DHAP 和 G3P 的产生来减少 ROS 的产生,从而减少葡萄糖的 DAG 合成,从而减少 NADPH 氧化酶复合物的活化。事实上,用 Zy/op 激活的 PKM2 缺陷型中性粒细胞降低了 p47-phox 的磷酸化,表明 NADPH 氧化酶复合物的激活受损(图 5c)。此外,用PMA(一种PKC直接激活剂)激活中性粒细胞绕过了ROS产生中PKM2缺陷的作用(图5d),表明PKM2缺陷的中性粒细胞中ROS产生的受损是由于PKC激活的上游事件造成的。 为了进一步探讨 DAG 对 ROS 产生的重要性,作者检查了 1-油酰基-2-乙酰基-sn-甘油 (OAG)(一种合成的 DAG 类似物)是否可以挽救 PKM2 缺陷的中性粒细胞或草酸盐处理的人中性粒细胞中的 ROS 产生。作者发现,在这两种情况下,OAG 都恢复了 Zy/op 激活的中性粒细胞的 ROS 产生(图 5e)。总之,这些数据表明 PKM2 通过调节葡萄糖的 DAG 从头合成来调节活化中性粒细胞中 ROS 的产生。通过这种方式,两条独立的途径(通过 PLC 激活和葡萄糖从头合成)负责维持中性粒细胞中的 DAG 水平,这对于 PKC 和 NADPH 氧化酶的激活非常重要。 Grüning 和合作者表明,丙酮酸激酶活性的降低会导致酵母中 PEP 的积累,通过与酶 TPI 的催化口袋结合来抑制酶 TPI。因此,作者还发现 PEP 在 PKM2 缺陷的中性粒细胞中积累(图 4f)。TPI 使 GAP 和 DHAP27 相互转化,PEP 与 GAP 竞争与 TPI26 的结合。然后作者假设当中性粒细胞中 PKM2 不存在或受到抑制时,PEP 会积累并抑制 TPI 活性。这会减少 DHAP 的积累,从而减少 DAG 的产生,从而损害 ROS 的产生。为了进一步探索这一假设,作者在用 Zy/op 激活之前用 PEP 处理野生型中性粒细胞 1 小时,发现 ROS 产生受损(图 5f)。此外,DHAP(图5g)和G3P(图5h)浓度和TPI活性(图5i)也降低。此外,PEP和草酸盐处理降低了p47-phox的磷酸化,这表明NADPH氧化酶复合物活化降低(图5j)。然后作者评估了 PKM2 缺陷的中性粒细胞和草酸盐处理的人中性粒细胞中的 TPI 活性。作者发现 PKM2 的缺失或抑制会降低 TPI 活性(图 5k)。为了进一步评估 TPI 对 ROS 产生的重要性,作者利用基于 CRISPR/Cas9 的编辑来破坏 NB4 细胞中的 Pkm2 和 Tpi,NB4 细胞是一种早幼粒细胞白血病细胞系,在暴露于全反式细胞后会分化为成熟中性粒细胞。作者发现,在缺乏 PKM2 和 TPI 的情况下,ROS 的产生会受到损害(图 5l)。总之,这些结果表明,PKM2 缺陷通过增加 PEP 积累来减少活化中性粒细胞中 ROS 的产生,从而抑制 TPI 活性和 DHAP 代谢,损害 NADPH 氧化酶激活和 ROS 产生(图 5m)。通过这种方式,PKM2 调节 DHAP-DAG-PKC-NADPH 氧化酶轴,促进中性粒细胞中 ROS 的产生。实验结果6PKM2 对于体内金黄色葡萄球菌杀灭很重要 金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌,是引起皮肤感染的常见病原体。金黄色葡萄球菌感染的一个标志是中性粒细胞募集和脓肿形成,这是消除病原体所必需的。为了确定 PKM2 在体内的重要性,作者使用了两种不同的小鼠模型:Pkm2fl/fl 和 Pkm2ΔLyz2 小鼠的腹膜炎和金黄色葡萄球菌皮肤感染,并评估了感染进展。对于第一个模型,作者通过腹膜内(i.p.)注射给小鼠接种金黄色葡萄球菌,并对动物进行18小时评估(图6a)。作者发现 Pkm2ΔLyz2 小鼠比 Pkm2fl/fl 小鼠更容易受到金黄色葡萄球菌感染,在血液(图 6b)和腹膜渗出液(图 6c)中显示出更高的细菌载量。尽管如此,中性粒细胞(图 6d)和单核细胞(图 6e)计数没有变化。此外,Pkm2ΔLyz2小鼠血浆中的IL-6增加(图6f),但渗出液中CXCL2(图6g)和CCL2(图6h)水平没有发现差异。 研究表明,皮内接种高剂量金黄色葡萄球菌的小鼠在 48 h 内表现出局部感染和炎症以及大量中性粒细胞募集的临床和组织病理学迹象。这样,对于第二个模型,作者在剃毛的小鼠背部的真皮中进行了两次3毫米的冲孔,并在伤口上接种了金黄色葡萄球菌(图6i)。评估麻醉小鼠的伤口损伤大小11天,并通过测量总损伤大小(平方厘米)来确定。作者发现假 Pkm2fl/fl 和 Pkm2ΔLyz2 小鼠具有相同的伤口愈合时间,在骨髓细胞中不表达 PKM2 的小鼠中,疤痕形成过程没有差异(图 6f)。然而,当接种金黄色葡萄球菌时,Pkm2ΔLyz2小鼠在感染的前四天比Pkm2fl/fl小鼠有更大的伤口(图6j,k)。此外,与Pkm2fl/fl相比,Pkm2ΔLyz2的伤口在接种48小时时具有更多的金黄色葡萄球菌菌落形成单位(CFU),尽管在以后的时间点具有相同数量的中性粒细胞(图6l,m)。此外,伤口组织匀浆中炎症细胞因子CXCL1(图6n)、TNF-α(图6o)和IL-6(图6p)的浓度没有差异。总而言之,这些结果表明 PKM2 对于控制体内金黄色葡萄球菌感染很重要。发布于 2023-07-29 10:48・IP 属地北京微生物赞同 43 条评论分享喜欢收藏申请
丙酮酸激酶 | Pyruvate kinase (PK) | MCE
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Pyruvate kinase (PK)
Pyruvate kinase (PK)丙酮酸激酶
释义:
Pyruvate kinase (PK)is an enzyme that catalyzes the conversion of phosphoenolpyruvate and ADP to pyruvate and ATP in glycolysis and plays a role in regulating cell metabolism.
丙酮酸激酶 (PK) 是一种在糖酵解过程中催化磷酸烯醇丙酮酸和 ADP 转化为丙酮酸和 ATP 的酶,在调节细胞代谢中起作用。
参考文献:
[1]. Israelsen WJ, et al. Pyruvate kinase: Function, regulation and role in cancer. Semin Cell Dev Biol. 2015 Jul;43:43-51.
[Content Brief]
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丙酮酸激酶M1型和M2型(PKM1/2)研究的戏剧性逆转和对Warburg效应的反思
作者:X-MOL
2019-05-28
本文获“BioArt”授权转载,版权归“BioArt”所有,任何转载需获得“BioArt”授权。编者按糖代谢异常是肿瘤的重要特征之一,具体表现在1956年德国生物学家Warburg提出的Warburg效应——即使在氧气充足的情况下, 肿瘤细胞仍大量摄取葡萄糖产生乳酸(有氧糖酵解)。丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase,PK)是调节糖酵解最后一步反应的关键酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 和ADP反应生成丙酮酸和ATP。丙酮酸激酶包括红细胞/肝型丙酮酸激酶(PKLR)和肌肉型丙酮酸激酶(PKM),PKM又有两个isoform,分别为PKM1和PKM2,近年来围绕PKM1和PKM2在肿瘤中的作用有大量的研究,然而存在不少的争议甚至有些是误导性研究,很多关键的科学问题扑朔迷离。有鉴于此,在多位从事肿瘤代谢相关研究的专家学者的建议下,BioArt特别邀请到了厦门大学林舒勇教授撰文,另外组织了林圣彩、赵世民、张华凤、杨巍维、江鹏、胡泽平等多位相关领域的权威专家进行意见征求与审稿,由于篇幅所限,本文只讨论围绕PKM在肿瘤代谢中的作用,而更复杂的涉及到PKM激酶活性的内容,后续BioArt会另行邀请业内专家讨论。代谢重塑是肿瘤的共同特征之一,改变对葡萄糖、氨基酸和脂质等营养物质的利用效率和方式会为肿瘤细胞带来生长、生存、增殖和迁移等方面的优势。最著名的肿瘤代谢重塑现象可属“瓦伯格效应”这种在肿瘤中糖代谢异常活跃的改变。糖代谢途径中有不少同工酶的存在,而分析肿瘤和正常细胞中这些同工酶的差异性表达正是肿瘤糖代谢研究领域的重要思路之一。这些同工酶中,对肌肉型丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase M,PKM)的差异性表达的研究恐怕是最为引人注目。PKM基因编码的丙酮酸激酶负责催化糖酵解途径的最后一步反应,即将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)上的磷酸根转移到ADP上,从而产生丙酮酸(Pyruvate)和ATP。有趣的是,编码PKM的基因可以通过对mRNA的差异性剪接选择第九个外显子或者第十个外显子而表达出PKM1和PKM2两种同工酶。PKM1和PKM2的表达有很大差异:PKM1主要在肌肉和脑这些对能量需求旺盛的分化终末细胞中表达,而PKM2则主要在胚胎细胞、干细胞和肿瘤细胞这些对合成代谢需求强的细胞中表达。虽然二者催化相同的反应,但仅有的22个氨基酸的差异赋予了PKM1和PKM2不同的属性,包括多聚化、酶活力和调控方式等。由于篇幅限制,本文不在此详述。关于肿瘤中PKM亚型的研究大概始于上世纪70年代。人们在多种肿瘤中检测到了PKM2的表达,令人吃惊的是,在大鼠肿瘤模型中,在正常组织中本应表达的PKM1在对应的肿瘤组织中被PKM2替代。2008年Lewis C. Cantley团队先是对人类肿瘤组织和癌细胞系中M1型和M2型丙酮酸激酶的蛋白水平进行了分析,发现M2型丙酮酸激酶在肿瘤中高表达。接着,他们采用敲低内源性的PKM的mRNA,再重新表达外源的PKM1或PKM2的cDNA的策略,研究两种同工酶在肿瘤中的差异。通过移植瘤实验,他们发现PKM2具有促进肿瘤生长的优势【1】。然而,五年之后的2013年,Matthew Vander Heiden团队的研究采用了敲除PKM基因中PKM2特有的第十个外显子的策略,发现PKM2的缺失反而会加速肿瘤的生长【2】。为了调和这两个乍一看相抵触的发现,人们结合2011年Cantley团队关于PKM2受活性氧刺激时会使葡萄糖代谢流向磷酸戊糖途径【3】,2012年Craig B. Thompson团队关于PKM2促进糖酵解中间代谢物流向丝氨酸合成途径【4】,以及2015年Matthew Vander Heiden团队关于PKM1通过抑制核酸合成而抑制细胞生长【5】等系列发现,逐渐形成了一个有些玄学意味的调和假说,即以PKM2替代PKM1,或者减少PKM2表达,都下调了PKM整体活性,这样可能使得糖代谢向PKM上游的合成代谢分支途径(如丝氨酸途径和磷酸戊糖途径)转向,而累积合成代谢的中间代谢物,一方面作为肿瘤增殖和生长的原料,另一方面又能促进糖酵解和瓦伯格效应。然而,2014年Jasom W. Locasale团队的对肿瘤瓦伯格效应相关的代谢谱的研究发现,丙酮酸激酶活性的变化和糖酵解中间代谢物的累积、糖酵解速率和瓦伯格效应都没有明显的联系【6】,这给了上述的调和理论打了个问号,也进一步对原先对PKM2促肿瘤生长的结论提出了挑战。为了解决PKM同工酶的迷思,2018年Nobuhiro Tanuma团队构建了新的基因敲入小鼠模型,分别以和内源PKM表达接近的水平在小鼠中只表达PKM1或者PKM2亚型。结果显示,在致癌剂或癌基因诱导等多种肿瘤模型中,PKM1都促进了肿瘤的生长,而PKM2则抑制肿瘤生长。PKM1肿瘤模型中尽管生物合成途径并未受明显影响,但丙酮酸激酶活性和糖酵解速率都比野生型增高【7】,这给了PKM同工酶之争一个直截了当的体内数据的回答。这也暗示我们,肿瘤中PKM2高表达可能和肿瘤中高表达的抑癌因子p53最初被认为是癌基因一样是个误会。因此,需要重新审视Lewis C. Cantley于2008年发表的关于“PKM2具有促进肿瘤生长的优势”的论文(BioArt注:该成果发表于Nature杂志,目前被引次数超过2000次)【1】,也就是说关于PKM2到底是不是促进肿瘤发生发展的元凶的问题需要慎重考虑,而不是盲目的引用作为论据支撑。总之,人们在关注PKM2的表达水平的同时,也应该留意其在体内环境的功能的变化,是否存在其抑癌功能损伤造成补偿性高表达的可能【8】。值得一提的是,瓦伯格效应的核心是糖酵解在肿瘤细胞中的大幅提高。然而,不少人会把这个概念曲解成肿瘤会选择提高糖酵解而降低氧化磷酸化供能。其实,这样的解读并不准确。正如Nobuhiro Tanuma团队的研究显示的,PKM1促肿瘤生长的模型中并未减少氧化磷酸化的水平。实际上,很多表现出高糖酵解活性的肿瘤并未出现线粒体活性的异常和氧化磷酸化的抑制,而仅仅是葡萄糖代谢进入TCA和氧化磷酸化的流量相对于大幅提高的糖酵解而言提升的程度不成比例。而丙酮酸本身除了进入TCA循环,用于氧化磷酸化之外,还向乳酸或乙酸【9】分流,甚至是进入线粒体后仅借用TCA循环的一步反应生成柠檬酸而进入脂质从头合成途径的分流,都可能造成氧化磷酸化途径的上升比例相对糖酵解而言较低的表象。近年来的研究更是发现不少肿瘤中氧化磷酸化是上调,而非被抑制。目前针对氧化磷酸化开发的肿瘤治疗药物中,有效的策略也多是抑制氧化磷酸化,而非提高氧化磷酸化【10】。人们常常误解的还有“限速酶”这一经典概念。对于糖酵解而言,人们常常简单粗暴地提到己糖激酶(Hexokinase,HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)是三个限速步骤,其中以PFK最为关键,因其本身是调控糖酵解的众多机制的靶点。然而,要明确的是,这三个限速酶的提出是以红细胞无氧酵解为背景的,而在不同的具体条件下,根据代谢流量和流量的差异,所谓限速酶并非一成不变。比如2014年Jasom W. Locasale团队运用同位素示踪等技术对肿瘤有氧糖酵解代谢组的分析发现,通常不太引人关注的GAPDH反而是最重要的限速酶。更重要的是,他们发现所谓的经典限速步骤既存在可预期的正调控机制,也存在着负反馈的可能,包括在某些条件下,抑制通过PFK的代谢流反而会提高糖酵解速率【6】。另外,杨巍维教授组也发现了巨噬细胞导致肿瘤细胞中的磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase 1,PGK1)由非限速酶变成限速酶的情况,这也说明所谓限速酶的定义要视具体情况而定【11】。而糖代谢流量的差异也并非肿瘤特有,面对因层层“剥削”造成的低氧条件的体内的正常组织【12】,以及部分有旺盛增殖需求的细胞【13】等等都完全可能存在与肿瘤类似的“代谢溢流”(overflow metabolism)的情况,从而使体内正常细胞的代谢流与以往体外细胞培养模型得到的结论有所不同。这就警示人们不应该机械地套用“限速酶”的概念,而应根据具体情况进行具体分析。温馨提示:今后BioArt会重点开辟类似的有助于促进学术争鸣的话题,同时也非常欢迎广大学术同行就自己熟悉的领域提出一些观点和看法,为避免文章的内容和观点有强烈的偏见或者常识性漏洞,BioArt会匿名组织同行专家进行审读。来稿请直接发送至:dingguangjin@bioart.com.cn,谢谢!参考文献1. Christofk HR, Vander Heiden MG, Harris MH, Ramanathan A, Gerszten RE, Wei R, Fleming MD, Schreiber SL, Cantley LC. The M2 splice isoform of pyruvate kinase is important for cancer metabolism and tumour growth.Nature2008 Mar 13;452(7184):230-3.2. Israelsen WJ, Dayton TL, Davidson SM, Fiske BP, Hosios AM, Bellinger G, Li J, Yu Y, Sasaki M, Horner JW, Burga LN, Xie J, Jurczak MJ, DePinho RA, Clish CB, Jacks T, Kibbey RG, Wulf GM, Di Vizio D, Mills GB, Cantley LC, Vander Heiden MG. PKM2 isoform-specific deletion reveals a differential requirement for pyruvate kinase in tumor cells.Cell.2013 Oct 10;155(2):397-409.3. Anastasiou D, Poulogiannis G, Asara JM, Boxer MB, Jiang JK, Shen M, Bellinger G, Sasaki AT, Locasale JW, Auld DS, Thomas CJ, Vander Heiden MG, Cantley LC. Inhibition of pyruvate kinase M2 by reactive oxygen species contributes to cellular antioxidant responses.Science.2011 Dec 2;334(6060):1278-83.4. Ye J, Mancuso A, Tong X, Ward PS, Fan J, Rabinowitz JD, Thompson CB. Pyruvate kinase M2 promotes de novo serine synthesis to sustain mTORC1 activity and cell proliferation.Proc Natl Acad Sci U S A.2012 May 1;109(18):6904-9.5. 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