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2024-03-09 21:52:26
Western Blot进阶技巧第一弹——从了解目的蛋白开始 - 知乎
Western Blot进阶技巧第一弹——从了解目的蛋白开始 - 知乎首发于科研百宝箱切换模式写文章登录/注册Western Blot进阶技巧第一弹——从了解目的蛋白开始爱必信生物爱必信Absin · 生命科学百宝箱Σ蛋白质印迹 (Western Blot)，相信大家对此都不陌生，做为检测蛋白表达及半定量的基础实验方法，也是很多小伙伴们初入实验室的第一门课。“上手容易，精通难”可谓对WB实验的最佳注释，初入实验室的“菜鸟”可以很快上手，做出漂亮的条带，做过多年的“大神”也可能一着不慎，实验“翻车”，结果一塌糊涂。有些实验室甚至流传着一些所谓的“玄学”，新手人品好，难做的条带给新手做等等。真的是这样么？实验技术可不是拼人品，靠运气的事儿，接下来小编将会为大家带来WB进阶技巧系列，干货满满，让大家提升WB实验技巧，成为真正的实验“大神”。首先，让我们了解一下什么是WB实验吧：▲【定义】WB又称为免疫印迹 (immune blot) ，是根据抗原抗体的特异性结合半定量的检测样品中的某种蛋白的方法。▲【原理】通过凝胶电泳，将不同分子量大小的蛋白质分离开，再利用特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。▲【应用】定性检测：目标蛋白有无，分子量大小；定量检测：检测目标蛋白含量（半定量）。图1. WB操作流程图看到这，相信之前对WB了解不多的同学也应该对WB有了一个基础的认识。那么，怎样可以把这看似简单的几步做好，拿到漂亮的实验结果呢？话不多说，上干货。小编首先要强调的一点，就是了解目的蛋白，这也是今天这篇文章主要给大家分享的内容。可能有的小伙伴会有疑问，为什么要讲一个跟WB操作没关系的步骤呢？说好的WB进阶呢？其实，这往往是很多新手忽视的关键点，对目的蛋白一知半解，是没有办法做好WB实验的，其他免疫学实验也是一样，可能有的小伙伴还不是特别相信，接下来让小编带大家看看为什么了解目的蛋白是如此的重要吧~了解目的蛋白对整个WB 实验的重要性： 1.了解目的蛋白，才知道目的蛋白在实验样品中是否有表达WB实验检测，很多小伙伴会遇到的问题之一就是无条带，也就是阴性结果，如何判断阴性结果是实验操作问题造成的“假阴性”还是本该如此的“真阴性”，这就需要大家在实验前，就对目的蛋白有一个清晰的认识。很多蛋白的表达是有组织特异性的，例如IL-10R，在视网膜，脾脏和肺腺癌组织中有高表达，其他组织表达含量较低；还有一些蛋白，则需要特定的刺激条件才会高表达，这种情况往往在磷酸化蛋白及炎症因子蛋白等中较为常见，如果未做特殊的处理，目的蛋白表达含量很低，无法被WB检测出。2.了解目的蛋白，才知道如何制备样本样本制备也是WB的关键步骤，后续的文章中也会为大家详细分析。如何选择合适的样本制备方法，关键因素就是要了解目的蛋白；除了上面第一步中的要了解目的蛋白表达组织，及预处理条件外，还需确认目的蛋白表达的亚细胞定位，例如，细胞膜蛋白，核蛋白，线粒体蛋白和胞浆蛋白的提取方式都不一样，选择合适的方式，才能制备合格的样品，方便后续的WB实验。另外一个需要注意的因素就是需要加入对应的蛋白酶抑制剂，这一点对于磷酸化的蛋白尤为重要，否则蛋白在提取过程中就被降解，会造成“假阴性”结果。3. 了解目的蛋白，才知道如何选择内参内参抗体，是WB实验中的重要参考，WB可以对目的蛋白进行半定量分析，判断不同样品中目的蛋白表达含量的多少，就是取决于内参的标定。内参选择在WB实验中是很关键的因素，可不是GAPDH或者β-actin万用的哦。内参如何选择，最重要的决定因素就是目的蛋白，尤其是目的蛋白的表达位置及预处理条件。小编在这里总结了一下内参的选择表，大家可以保存哦~好了，相信大家应该知道实验前了解目的蛋白的重要性了吧，如何了解目的蛋白呢？可以通过UniProt网站搜寻蛋白的相关信息，也可以在Pubmed上查阅对应的研究文献，相信聪明的小伙伴们肯定可以做好的，今天的分享就先到这，接下来我们还会分享整个WB操作过程中的细节，如果您也有实验心得想分享给大家，欢迎投稿！发布于 2020-06-03 14:42分子生物学生物化学酶赞同 786 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录科研百宝箱absin，您身边的科研
血泪教训，Western blot史上最全避雷手册。 - 知乎
血泪教训，Western blot史上最全避雷手册。 - 知乎首发于Western blot踩雷和制作大全切换模式写文章登录/注册血泪教训，Western blot史上最全避雷手册。聊点学术AI病理+量化病理方案设计提起Western blot (WB)，很多人都能哭诉半宿。这是一个基础实验，也是一个让大家头疼的实验，简称“玄学”。话不多说，做过的都懂。今天给大家提供WB最全避雷手册，希望大家能愉快实验，顺顺利利。倾 尽 全 力，长 文 预 警1、WB有什么优点？答： 灵敏，可达ng级，用ECL显色法可达pg级。灵敏，相对便宜且特异性高。2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：a) 你的细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚； b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性； c) 你的抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，一般需96℃以上10-15min左右； b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时需再加入适量上样缓冲液。4、我做的蛋白质分子量很小(10KD左右)，请问怎么做WB？答：尽量选择0.2μm的膜，缩短转移时间；也可将两张膜叠在一起再电转。5、我的目的带很弱，怎么加强？答：最主要是加大抗原上样量；同时也可以将一抗稀释比例上调。6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜，此孵育条件比37℃1h要温和很多)，并提高封闭液浓度。7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新进口的显色底物。8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中本身含双氧水，不稳定，见光或温度高时易失活；现配现用。c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗时间过期，或平时使用不当导致二抗失活。9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；b) 显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。10、DAB好还是ECM好？答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到检测的阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。具体选择还是要看你实验的情况，目前大家一般使用ECM。11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？答：a)所检测的抗原形成二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。b)蛋白本身有修饰如糖基化、磷酸化等均会增大蛋白分子量。12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够。(注意！Marker并不是蛋白是否转移到膜上的标准，它只是为我们提供简单的指示作用。)13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。建议可多种抑制剂混合使用。14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和WB试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：a)免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；WB可以特异性检测某个蛋白质分子，如抗体选择合适，灵敏度很高。WB进行定量，但是不能定位。b)两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。15、做WB时，提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂)，用了一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了一种一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？答：怀疑是样品问题，可能是：a)样品不能反复冻融，建议制备好样品后混匀，小体积分装；b)样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查WB过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂(PMSF在水溶液中不稳定，30min就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF，样品处理超过1小时，补加1次。见水易分解，使用前加入)。16、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？答：一般5×10^6就足够了；特殊情况需根据自己的研究来确定。17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对WB有无影响？答：能，完全没有问题；这是两个不同的实验。18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品；有时如果抗体特异性高且效价高，同时使用2种一抗，可在一张膜上检测2种不同蛋白。19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；部分膜蛋白不好提取，尤其是亚细胞器的膜蛋白。可考虑最新的invent柱式提取法，提取效率高，蛋白丢失较少。20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以减少电流延长时间，加20％甲醇；还有一种办法就是采用最新的WES来检测，灵敏度极高，但价格贵。21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WB吗？答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间，但必须控制温度，保证低温电泳和电转。22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的，建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，以增大上样孔体积，可以试1.5mm厚的胶。23、蛋白变性后可以存放多久？答：-80℃，若没有反复取出冻融，保存一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。24、我所测定的蛋白分子量是100KD左右，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意目的条带位置肯定会发生一定地偏移。25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含较多的生物素，用BSA(5%、8%)代替会好一点。26、一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？答：WB一般上样30-100μg不等，结果跟目的蛋白的表达丰度、上样量、一二抗的量以及孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了。当然有的蛋白不适合WB的怎样做也不行，或者抗体效价低则注定事倍功半。27、做组织样品的WB的时候，怎样处理样品？答：必须进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温)，蛋白质溶解度会更好，离心要充分(12000转/min，10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。28、大分子量蛋白200KD或以上，在做WB要注意什么呢？答：做200KD蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；胶很软，剥胶时要小心；转移时间需要相应延长(至少300mA，3h或以上)；必须要使用大量程的Marker(否则出现杂带不知如何分析问题)。29、有什么方法可以提高上样量？答：a)可以浓缩样品；或增大上样体积来增大上样量；b)用5X的上样缓冲液来稀释变性。30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WB则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了，但是不要超载。31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉大部分的非特异性底色。32、要做磷酸化某因子WB，其二抗有何要求？答：主要是一抗要选择好。对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。33、免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称抗原表位)，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，蛋白煮后变性其构象会消失，仅剩下一级结构。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般我们做的时候没有这么复杂的考虑，多看看抗体说明书所注明的实验范围来做，这样省时省力。34、WB中抗体的可以重复应用吗？答：所有的抗体工作溶液一般不主张回收冻存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用，4度保存，避免反复冻融。35、在做WB时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？答：肯定可以，建议先检查非磷酸化蛋白，然后使用抗体洗脱液将抗体洗去，再在该膜上重新孵育磷酸化一抗。37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？答：这是正常的，大分子的蛋白转移很慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡(转过的表现)。注意一点：丽春红染色较好，不是你的目标蛋白成功转移至膜上的标准，这是两个概念，；丽春红染色很多时候只是提供一个粗略的参考而已。38、做WB时，同样的抗体在免疫组化能做出，而WB却不能？答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和免疫组化。39、如果是6×8转印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。建议尽量还是裁剪膜，不要整张膜孵育，费抗体而且可能会孵育不均匀(个人建议，仅供参考)。40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液；小编发现电泳时产热也很厉害，其实可以在电泳时加冰浴。41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？答：没有问题，就是你胶里的水分被电泳产热蒸发了。其次配好的胶在过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点电泳液保持湿度就可以了；也可能30%聚丙酰胺有问题，你可以重新配制一份试试或直接买商用的30%聚丙酰胺；能够替换的试剂，尽量换一下，选用进口试剂。42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？答：这么广的分布不好转移，一般建议：21KD和66KD可以一起转，一起做。采用12％SDS-PAGE，湿转120mA，45-60min就可以了，可以根据你实验室师兄师姐的调节；而170KD蛋白用7%SDS-PAGE，至少200mA 120min。43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜(0.2μm)。44、我用的是可视Marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。Marker是新买的。答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择，现在已经有商用梯度胶了，大家可自行选择。45、是否WB实验半定量一定要加内参？答：对于发表文章的实验一定要加内参，实验严谨，证据充分。46、核内抗原WB内参选择什么合适？答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，动动手查查就可以选出你要的内参。(也可以私信小编哦)47、做半定量WB，内参β-actin，GAPDH哪个好？答：一般选用β-actin就可以，也可以使用GAPDH，但是如果做能量、代谢这方面的研究还是尽量选择β-actin。48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持冰浴，保持低温。除非有文献特别指明必须使用特殊方法，一般来说没有区别。49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST的T是Tween吗，浓度是多少？答：T就是Tween，全称Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST)，组成：8g NaCl，2.42g Tris base，加水800mL充分溶解, 加 500-1000μL 的 Tween-20，用HCl 调节pH 至 7.4，加水定容至 1L。50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。小编建议尽量还是4℃过夜孵育，原因在上面已说明。51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。52、怎样才能跑出漂亮的胶，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？答：影响跑胶跑的质量，提供2个小建议：a)小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。b)胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。54、电泳中常出现的一些现象：①“︶” 条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；电泳系统温度偏高，而且电场强度太大(电泳的电场大致呈现U形，所以因为赶时间而加大电压可能会出现这个)。②“︵” 条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。③条带拖尾原因：样品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。④纹理(纵向条纹)原因：样品中含有不溶性颗粒，可能抽提蛋白时出了问题。⑤条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜，一定要子平面台子上电泳，胶要做好。⑥条带两边扩散原因：加样量过多，弥散至孔周围了，减少上样量或者使用5X上样缓冲液。55、WB结果中背景较高可能的原因及建议：①膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。②一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。③ 一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。④选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。⑥检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。56、WB结果中杂带较多可能的原因及建议：①目的蛋白存在多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点等等)，本身可以出现多条带。查文献或生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，去除修蛋白饰后确定蛋白实际大小，这个需要一定的生物化学基础和生信分析能力。②目的蛋白有其它剪切本，查阅文献或生物信息学分析其可能性。③样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制剂；样本处理在冰上操作。④上样量过高，过于敏感，适当减少上样量。⑤一抗特异性不高，重新选择或制备高特异性的抗体。⑥一抗不纯，纯化抗体。⑦一抗或者二抗浓度偏高，适当降低抗体浓度。57、WB结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：①你所检测的样本中不表达目的蛋白，选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性，同时查阅文献。②检测样本低表达目的蛋白，提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。③转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。④抗体不能识别测试种属的相关蛋白，购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。⑤一抗孵育时间不足，建议4℃结合过夜。⑥二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体。⑦洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。58、其它现象：①膜上多处出现黑点或黑斑，原因有2点，抗体与封闭试剂发生非特异性的结合；或者配的奶粉没有充分溶解，奶粉团粘在膜上而没洗干净。②反白(条带显白色)，原因一般是目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。③蛋白分子量偏低或偏高，原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。59、安全爱护身体，保护自己。安全第一，实验第二。安全无小事！操作有毒试剂时，一要定带手套和口罩，且操作挥发性试剂一定要在通风橱中进行。This is the dividing line.以上为本期内容。简单地为大家提供一些建议，希望大家的实验能顺顺利利，早日完成SCI大业。发布于 2020-09-03 08:58蛋白质分子生物学实验赞同 119757 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录Western blot踩雷和制
蛋白免疫印迹（ Western Blot）详细操作步骤 - 知乎
蛋白免疫印迹（ Western Blot）详细操作步骤 - 知乎首发于细胞生物切换模式写文章登录/注册蛋白免疫印迹（ Western Blot）详细操作步骤岚solo原理：蛋白免疫印迹（ Western Blot，WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 WB 是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本SOP包括Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成 WB。一、蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备二、 电泳1 PAGE 胶的制备2 蛋白分子量 Marker3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳三、 转膜与显色（ Western Blot）1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测：丽春红4 膜的封闭5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色四、常见问题分析与解决方案五、试剂及缓冲液配方一、蛋白样本提取制备蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，是决定 WB 成败的关键步骤之一。蛋白提取总体原则与注意事项包括：1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）。2) 保证蛋白处于可以溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、 表面活性剂、还原剂等的选择实现）。3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（全程保证在冰盒中低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。4) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）。5) 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。1-1 细胞或组织裂解1-1-1 细胞裂解1. 培养的细胞经预冷的 PBS 漂洗 2 次；2. 吸净PBS，加入预冷的裂解液（使用前裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂）(0.1 ml /10６ cells)；结合不同培养板及实际细胞数量级及参照下表加入相应量裂解液： 面积（cm2）细胞量（个）裂解液量（μl）96 孔培养板0.320.4-1.0×10520-5024 孔培养板20.3-0.6×10630-6012 孔培养板4.50.6-1.2×10660-1206 孔培养板9.61.2-2.5×106120-2503.5 cm 培养皿81.0-2.0×106100-2006 cm 培养皿212.5-5.0×106250-50010 cm 培养皿550.7-1.5×107700-150025cm2 培养瓶253.0-6.0×106300-60075cm2 培养瓶751.0-2.0×1071000-20003. 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的离心管中；不能用细胞刮子刮取的情况可直接冰上裂解30min后用枪多次吹打至细胞完全裂解；4. 4℃摇动 30 min；5. 4℃离心 12000 rpm，20 min；6. 轻轻吸取上清，转移至新预冷的离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。7. 目的蛋白非细胞外基质（ECM）或对胰酶不敏感时也可以采用胰酶消化法收集细胞（即细胞吸去培养基，PBS 漂洗 2 次，加入胰酶消化至脱落，加入预冷的PBS，移入预冷的EP管，离心收集细胞，加入预冷裂解液（使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），依次按上面4，5，6步骤处理。1-1-2 组织裂解1. 用预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解；2. 将组织块放在圆底的微量离心管或 EP管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C；3. 每约10 mg组织加入约200 μl 预冷的裂解液（使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），冰浴匀浆后置于4℃摇动2h，裂解液体积与组织样本量有适当比例（最终的蛋白浓度至少达到1 mg/ml，理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).4. 4℃离心 12000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。1-2蛋白酶抑制剂本实验室使用的蛋白酶抑制剂为PMSF，抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）。在水液体溶液中不稳定，30min就会降解一半，应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。工作浓度一般用1mM，1:100(V/V)加入贮液（100mM PMSF），样品处理超过1h，补加一次。PMSF剧毒,为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作．PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。除PMSF外，裂解液中还需加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（做磷酸化蛋白时必须加），推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或 COOKTAIL，或按下表配制：备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下：所有步聚均需在通风橱中进行：1）. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液；2）. 用盐酸HCl 调至pH 9.0；3）. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发；4）. 冷却至室温；5）. 再调pH 至 9.0；6）. 再煮沸至无色；7）. 重复上述过程，直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0；8）. 用水定容至原体积；9）. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用。1-3 蛋白定量BCA 法以牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将 Cu2+ 还原成 Cu1+， BCA（Bicinchoninic 酸）螯合 Cu1+ 作为显色剂，产生兰紫色并在 562 nm 有吸收峰，单价 Cu1+ 与蛋白呈剂量相关性，灵敏性很高，试管法可测范围 20-2000 μg/ml，微孔法为 0.5-10μg/ml。不易受一般浓度去污剂的干扰。可耐受螯合剂、略高浓度的还原剂的影响，40min内抗干扰能力强。BCA测定方法如下：1) 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂：孔号01234567蛋白标准溶液（μL）01234567去离子水（μL）2019181716151413对应蛋白含量（μg）051015202530352) 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；3) 各孔加入 200μL BCA 工作液；4) 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃放置 30 min，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5) 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20μL，加入 BCA 工作液 200μL，充分混匀，37℃放置 30 min后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值；6) 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。1-4 电泳上样样品的准备1-4-1变性、还原蛋白样本一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如 SDS 的上样 buffer （loading buffer），并于 95-100°C 煮沸5 min，对于多次跨膜蛋白，可以于 70°C 加热 5-10 min，本实验室的 上样 buffer 称为5×SDS凝胶还原型加样缓冲液，上样时与样本1：4混合后变性上样即可。SDS是阴离子去污剂、变性剂。氨基酸侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束，蛋白质-SDS 胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异，SDS与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。1-4-2 天然和非还原样本某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的 WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加 SDS，样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些 cysteine 基的氧化态，即loading buffer 和电泳液中不加入β-巯基乙醇和或DTT。data-draft-type="table" data-size="normal" data-row-style="normal">蛋白状态凝胶状态loading buffer电泳缓冲液还原—变性还原和变性有β-巯基乙醇或DTT ，有SDS有 SDS还原—天然还原和非变性有β-巯基乙醇或DTT ，无 SDS无 SDS氧化-变性非还原和变性无β-巯基乙醇或DTT ，有 SDS有 SDS氧化-还原非还原和天然无β-巯基乙醇或DTT ，无 SDS无 SDS注：除说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性和还原电泳二、 电泳SDS-PAGE基本原理：1）. SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入 SDS 和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS 是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。2）. 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。3）. 蛋白质分子结合 SDS 阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。2-1 PAGE胶的制备聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称 Acr）和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称 Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素 AP）和加速剂（四甲基乙二胺 TEMED）作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原作用来完成的。催化体系主要有化学催化（AP-TEMED）和光化学催化（核黄素-TMTED）体系。PAGE胶分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液 pH 值与凝胶中的相同。带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续电泳 作用缓冲液 PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8 Tris-HCl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8 Tris-HCl高，根据蛋白大小不连续系统的浓缩效应：凝胶层的不连续性：浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。缓冲液离子成分和pH的不连续性：HCl易解离出Cl- ，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH6.8 的缓冲液中解离度很小，仅为 0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。蛋白质均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离 子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.8的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。根据SDS聚丙烯酰胺的有效分离范围选择分离胶浓度。SDS-PAGE胶有效分离范围聚丙烯酰胺胶浓度%线性分离范围/kDa557-2127.536-941020-801212-601510-43分离胶的配置：将二块玻璃板叠放整齐，用夹子两边夹好，将这二块玻璃板固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下缘划线，指示灌胶位置，拔去梳子。在分离胶的配置烧杯中按配方加料，混匀后利用移液器将分离胶(避免气泡产生)滴入二块玻璃板之间，至液面达到梳子下缘1cm 处。用移液器缓慢加入饱和正丁醇或水，注意不要冲乱胶面。静置，待分离胶聚合后，倒去或用滤纸吸去水层。浓缩胶的配制：在浓缩胶的配置烧杯中按配比加料，混匀后即刻用移液器加浓缩胶(避免气泡产生)覆于二块玻璃板之间的分离胶之上至满，轻轻插入梳子（插入梳子时一边倾斜直至全部插入，防止产生气泡）。静置待其凝结后，即制成凝胶板。凝胶制成后最少需放置2h或最好湿盒过夜后才能使用，保证交联反应完全。2-2 蛋白分子量 Marker预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪。2-3阳性对照目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性、特别是一抗的质量和效率。建议使用对照，可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提对照样本。2-4 内参对照管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个 WB 实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照必须设立。内参名称分子量大小适用范围β-actin43kDa胞浆和全细胞GAPDH30-40 kDa胞浆和全细胞Tubulin55 kDa胞浆和全细胞VCDA1/Porin31 kDa线粒体COXIV16 kDa线粒体Lanin B166 kDa细胞核（不适于去除核膜的样本）TBP38 kDa细胞核（不适于去除DNA的样本）2-5上样电泳蛋白抗原上样量为30 ug。根据样品量选择SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度，一般0.75mm间隙15孔的上样量 < 15uL/孔，1mm间隙10孔的上样量 < 30ul/孔。上样：将二块玻璃板制成的凝胶板子上的夹子卸去，将凝胶板垂直靠在电泳槽里的电源架上，使凝胶板的凹沿面靠向电源架。通常两块凝胶板共用一个电源架。将凝胶板与电源架按要求固定于电源槽内。按要求加入电泳缓冲液，使分别加入在两块凝胶板中间电源架内的电泳缓冲液与加入在电泳槽中的电泳缓冲液互不相通。轻轻地拔去凝胶板内的梳子。取处理后的样品液，用微量进样器吸取适量样品液，将样品液缓缓加入凝胶板内地凹口部位(样品点入处)。注意不要冲散样品。电泳：用二根导线连接电泳槽与电泳仪，注意红色与黑色电极的插头和插口相配。电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，打开电源将将电压调到80v（一般15min左右），而在溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，将电压调到120v至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。三、 转膜与显色3-1胶中蛋白的检测电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用锌染（负染）、胶染（blue silver）或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的锌染法，否则可以采用不可逆考马斯亮蓝法染色。锌染法（负染）：电泳胶用蒸馏水洗30秒，加入含0.1% SDS 的0.2 M 咪唑溶液摇动染色 10-15 min，再用去离子水洗数秒，加入0.2 M ZnSO4溶液摇动直至在暗背景下蛋白出现透明条带（约1min），移去ZnSO4溶液加入去离子水中止显色；胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。胶染（blue silver）法：电泳胶用蒸馏水洗数30秒，考马斯亮蓝G-250染液室温染色1h至过夜，保持摇匀，回收染液，倒入数次去离子水摇动至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。考马斯亮蓝R250法：电泳胶用蒸馏水洗数30秒，考马斯亮蓝R-250染液室温染色1h至过夜，保持摇匀，回收染液，用蒸馏水洗数分钟，倒入脱色液摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。 考马斯亮蓝快速染色脱色方法： a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现 胶碎裂的情况。 b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。 c. 回收染色液。d. 加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。 h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。3-2 蛋白转膜杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于 Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC） 和PVDF 膜。膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用 0.45μm 和 0.2μm 两种规格的膜。大于20kD 的蛋白可用 0.45μm 的膜，小于20kD 的蛋白就要用 0.2μm 的膜了，如用 0.45μm 的膜就会发生“Blowthrough”的现象。最常用于 Western Blot 的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE 纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和 NC 膜的特点相似，主要用于核酸杂交。硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC 与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在 NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC膜韧性较差，易损坏。聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合，非常适合于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和 1-5 秒钟。膜的选择主要根据：1. 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；2. 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；3. 如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。蛋白因结合 SDS 而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD 的蛋白。湿式转膜三明治排列为：海绵/滤纸/ 胶/ 膜/滤纸/ 海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确，负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。SDS-PAGE电泳完毕，用刀片或薄板将凝胶板的两块玻璃轻轻撬开，使凝胶倾伏在其中一块玻璃板上。用刀片在凝胶上沿分离胶与浓缩胶的交界处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序。然后将胶小心移入转膜缓冲液中。剪下与分离胶同样大小的0.45um的PVDF膜，以甲醇浸泡5s。剪下6张同样大小的滤纸，与PVDF膜，胶同时以转移缓冲液平衡15min。在转膜装置上从负极（黑底）到正极放置海绵垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵垫片（由下而上），放置时一定要排除气泡，特别是膜与滤纸、胶与膜、滤纸与胶之间。设置转膜电流为恒流，200mA，时间约需40min（蛋白大小不同所需时间不同，一般1KD约为1min）。转完后，取出膜，在与胶相同的位置小心剪去一角，标示电泳方向及吸附有蛋白的膜面。标准的电转缓冲液为 1X Tris-glycine buffer 不含 SDS，但加入 20%甲醇，如果转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入 SDS 使之终浓度为 0.1%。PVDF 膜需要浸泡甲醇中 1-2 min，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5 min，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 min，否则转膜时会导致条带变形。电转移缓冲液中 SDS 与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效率：a) 大蛋白（大于 100 KD ）1) 对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶， 8% 或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，2) 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此，转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为 0.1%的 SDS，以避免出现这种情况，甲醇易使SDS 从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至 10%或更低，以防止蛋白沉淀。3) 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。4) 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是 PVDF 膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF 需用甲醇活化。5) 选择湿式， 4℃ 转膜过夜，以取代半干式转膜。b) 小蛋白（小于 20 KD）1) SDS 妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加 SDS 。2) 保持 20% 的甲醇浓度。注意事项：1. 避免直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑2. 排列三明治时，尽量用移液器或 15 ml 试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有的培养皿中以防止气泡产生，请戴手套！3. 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效4. 鸡抗体易于与 PVDF 膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。3-3 膜上蛋白的检测：丽春红染色为检测转膜是否成功，无预染蛋白Marker时可用丽春红染色。染色方法：将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色 5 min，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用 TBST 或水重新洗后再进行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST洗后进行封闭。3-4 膜的封闭杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是 BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和 Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液 PBST 或者 TBST。Tween-20 的作用：Tween-20 是一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。在做 westen blot 时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween 这种非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。离子型去污剂如 SDS 则破坏蛋白的结构。传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或 BSA。脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。某些抗体用 BSA 封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法。一般封闭条件为：5% 脱脂奶粉或 BSA 溶液室温或者 37℃缓慢摇荡 1-2 h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。封闭完成后进行洗膜，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min洗1次。3-5一抗的孵育孵育 Buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用封闭液稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:1000-1:2000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或 4℃在摇床上缓慢摇动孵育2 h。孵育时间：一抗的孵育时间可从2h至过夜（一般不超过 18 h）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在 4℃进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。孵育完成后吸取一抗，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min，重复洗3次。3-6二抗孵育用封闭液稀释二抗至抗体说明书规定浓度，将转有蛋白的PVDF膜浸入装有抗体的方形保鲜盒中，震荡孵育1-2 h。孵育完成后吸取二抗，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min，重复洗3-5次。3-7化学发光酶促反应比同位素安全且快速，已经成为 Western Blot 的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光和底物显色，前者灵敏度很高，已经达到皮克级别，甚至还有飞克级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。辣根过氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大 1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。发光液（A液、B液）1：1配置（注意避光），用移液器吸取合适量的发光液至覆盖PVDF膜，ECL发光仪上曝光并采集图像。四、常见问题分析与解决方案五、试剂及缓冲液配方1. 试剂:国药AR：丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵(AP)、Tris、SDS、甲醇、乙醇、甘氨酸(Gly)、冰乙酸、磷酸、硫酸铵（常温保存）。2. 其它试剂：BSA、甘油、β-巯基乙醇、溴酚兰、Tween20、TEMED、丽春红、考马斯亮蓝G250/R250（常温保存）；ECL发光液（4℃保存）；二抗、蛋白分子量marker、PMSF（-20℃保存）。3. 耗材：PVDF膜（millipore）、滤纸、枪头。4. 缓冲液：30% Acr/Bis（棕色瓶）、10% 过硫酸铵、1×转膜缓冲液、5%BSA或脱脂奶粉封闭液（4℃保存）；1.5M Tris-HCl（pH8.8）、1M Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS 、5× SDS凝胶还原型加样缓冲液、10× TBS、10×Tris-Gly电泳缓冲液、10×转膜缓冲液、1× Tris-Gly电泳缓冲液、TBST（常温保存）。5. 缓冲液配制：a) 30% Acr/Bis：丙稀酰胺29.2g，甲叉双丙稀酰胺0.8g，双蒸蒸馏水溶解定容至100ml，过滤备用，4°C棕色瓶保存。b) 1.5M Tris-HCl（pH8.8）：Tirs 18.2g，溶于蒸馏水中，定容至100mL。加入盐酸调节pH值至8.8，常温保存。c) 1M Tris-HCl（pH6.8）：Tirs 12.1g，溶于蒸馏水中，定容至100ml。加入盐酸调节pH值至6.8，常温保存。d) 10% SDS：SDS 20.0g溶于蒸馏水中，定容至200ml，加热至68°C助溶。常温保存。e) 10% 过硫酸铵(AP)：过硫酸铵0.1g，溶于1ml 蒸馏水中，现配现用或分装冷冻备用。4°C保存时最多不超过2w。f) 5×SDS凝胶还原型加样缓冲液：0.25 M Tris-HCl (pH 6.8) 1ml、SDS 0.25g、甘油 0.189g、溴酚兰 25mg，双蒸水定容到5ml，使用前加入β-巯基乙醇0.5ml。g) 10× Tris-Gly电泳缓冲液：Tris 30.2g，甘氨酸188g，SDS 10g，加入双蒸水定容至1L。1× Tris-Gly电泳缓冲液：用100ml量筒取100ml 10× Tris-Gly电泳缓冲液，加入到1000ml容量瓶中，用蒸馏水定容到1000ml。h) 10×转膜缓冲液： Tris 30.3g 、甘氨酸151.1g 、定容至800ml。1×转膜缓冲液：10×转膜缓冲液80ml、甲醇200ml, 加蒸馏水720 ml。i) 10× TBS：Tris 24.2g、氯化钠80g，双蒸水定容至1L，调PH 7.6。j) TBST：用100ml量筒取100ml 10× TBS，加入到1L容量瓶中，用蒸馏水定容到1L，再加入1ml Tween 20混合均匀。k) 封闭液：2g BSA或脱脂奶粉，溶于装有40ml TBST的50ml离心管中，配成5% BSA或脱脂奶粉封闭液，现配现用，短期4°C保存，较长时间则冷冻保存。l) 100mM PMSF：称量0.174g PMSF(针状结晶固体)溶于10ml 无水乙醇，震荡混匀，保存在-20°C。m) 2%的丽春红贮备液： 丽春红2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，加水定容至100ml，过滤，常温保存。丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O。n）考马斯亮蓝R250染色液：0.25%考马斯亮蓝R250，40%双蒸水， 10% 冰乙酸，50%甲醇混匀，过滤，常温棕色瓶保存。o）考马斯亮蓝R250染色脱色液：常温保存： 67.5%双蒸水，7.5%冰乙酸， 25%甲醇混匀，常温保存。p）考马斯亮蓝G-250染液： 10%磷酸，10%硫酸铵，0.12%考马斯亮蓝G-250， 20%甲醇，常温棕色瓶保存。配制方法：按就次序依次加入10%磷酸，10%硫酸铵，等完全溶解后加入0.12%考马斯亮蓝G-250，等完全溶解后加入20%甲醇混匀，过滤。 分离胶配方 5%浓缩胶配方文章来自：无锡菩禾生物医药技术有限公司编辑于 2020-08-13 15:26蛋白表达细胞生物学分子生物学赞同 7718 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录细
WB实验步骤关键点合集| Abcam中文官网
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abcam 整理了 WB 实验中不容忽视的小细节，并将精华内容制作成了 WB 实验check list，方便您对照这张表来检查每个实验步骤的关键点。您可以点击图片下载 Checklist。
WB 实验流程通常包括样本制备、电泳、转膜、封闭、抗体孵育和检测 6 个部分。这 6 个部分是环环相扣，每一步的疏忽都可能导致一无所获。
样本选择和处理蛋白分子参与生命活动的各个过程，其功能复杂多样，有些蛋白可能只在部分组织和细胞表达（图1）。有些蛋白可能需要诱导，才能表达或表达量增加（图2）。有些蛋白可能存在翻译后修饰，导致其蛋白分子量大小可能与预测不符（图2，3）。有些蛋白可能有多个异构体或者容易被降解，导致出现多条条带的现象（图2）。因此，只有足够了解您研究的蛋白特性，您才能在样本的选择和处理上得心应手，美美的开启您的 WB 之旅。图1 MMP9在不同细胞系表达水平不同。Lane 1:LoVo全细胞裂解液；Lane 2:Huh7全细胞裂解液；Lane 3:MCF7全细胞裂解液；Lane 4:HeLa全细胞裂解液；Lane 5:Caco-2全细胞裂解液； Lane 6:A549(血清饥饿诱导过夜)全细胞裂解液；Lane 7:A549(血清饥饿诱导过夜，80nM TPA处理24小时)全细胞裂解液；Lane 8:MDA-MB-231(血清饥饿诱导过夜)全细胞裂解液；Lane 9:MDA-MB-231(血清饥饿诱导过夜后，200nM TPA处理24小时)全细胞裂解液；Lane 10:HepG2全细胞裂解液。图2 在HeLa细胞中HIF-1 alpha蛋白需低氧诱导才表达。Lane 1 : 未处理C6 (rat glial tumor glial cell)全细胞裂解液；Lane 2 : 400 µM CoCl2和200 µM MG-132 (ab141003)处理4小时后的C6全细胞裂解液。预测分子量: 92 kDa；检测到分子量: 110 kDa。图3 SQSTM1 / p62蛋白。Lane 1:人肝脏裂解液；Lane 2:人肾脏裂解液；预测分子量: 47 kDa；检测到分子量: 62 kDa。
样本制备样本制备是 WB 实验的开端，裂解液的选择、样本的破碎方法、温度和变性等都会影响样本制备是否成功。以下是一些样本制备过程中需关注的小细节：添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。如果涉及蛋白修饰的检测，需添加相应的去修饰酶抑制剂，例如对于磷酸化修饰蛋白添加复合磷酸酶抑制剂，以防止蛋白在提取时被去磷酸化。选择合适的裂解液来富集更多靶标蛋白。超声破碎处理细胞以富集更多靶标蛋白。超声处理富集THP-1细胞中的Histone H3蛋白。Lane 1:超声处理THP1全细胞裂解液；Lane 2:未处理THP-1全细胞裂解液。整个样本制备过程中，保持样本置于冰上。一般来说，蛋 95℃变性5-10min。对于有些多次跨膜蛋白，37℃或者70℃ 10min可能效果更好。通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本蛋白浓度。
电泳电泳可以将靶标蛋白与其它蛋白分开，更易检测。不同浓度的分离胶对不同分子量的的蛋白分离效果是不同的。蛋白的上样量，也会影响是否可以检测到有效信号或者获得漂亮的图片。设置阳性和阴性对照不仅有助于分析蛋白功能，在WB实验失败时也有助于分析失败的原因。在电泳时需要特别关注以下小细节：根据蛋白大小选择合适的电泳胶浓度，以确保不同蛋白的迁移速率与分离程度最优。具体可参考表1。表1 不同浓度的分离胶选择蛋白的分子量大小分离凝胶丙烯酰胺百分比4–40 kDa20%12–45 kDa15%10–70 kDa12.5%15–100 kDa10%25–200 kDa8%对于分子量较小的靶标蛋白(如分子量<25 kDa），请使用较高浓度的分离胶进行电泳。对于分子量较大的靶标蛋白（如分子量>100 kDa），请使用较低浓度的分离胶进行电泳。至少上样20μg总蛋白进行电泳。建议使用阳性和阴性对照。
转膜转膜是指将蛋白从电泳胶上转移到膜上，方便目标蛋白的检测。转膜缓冲液中SDS和甲醇含量对不同分子量蛋白的转膜影响是不同的。PVDF膜孔径的选择依赖于蛋白分子量大小。转膜结束后，丽春红染色使蛋白可视化，方便判断转膜是否成功。甲醇浓度对转膜效率的影响。HeLa全细胞裂解液中DNA PKcs蛋白检测。Lane 1: 转膜缓冲液中甲醇浓度10%；Lane 2: 转膜缓冲液中甲醇浓度20%。丽春红染色判断转膜是否成功。左图：转膜成功；右图：转膜失败。在转膜时需要特别关注以下小细节：对于分子量较大的靶标蛋白，建议在转膜缓冲液中加入SDS至终浓度为0.1%。对于分子量较大的靶标蛋白，建议使用0.45μm的PVDF膜。对于分子量较小的靶标蛋白，建议使用0.22μm的PVDF膜。对于分子量较大的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用10%甲醇或更低浓度。对于分子量较小的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用20%甲醇。PVDF膜激活完成后充分清洗，完全去除膜上残留甲醇。转膜开始前请确认胶与膜之间没有任何气泡。建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功（如果选择荧光标记检测，请确保丽春红完全清洗干净）。
封闭封闭是使未有蛋白吸附的区域被封闭，以防止抗体的非特异性结合，从而降低背景，提高检测灵敏度。常用的封闭液有5%脱脂奶粉和5% BSA或特定封闭液。在封闭时需要特别关注以下小细节：没有适用于所有体系的封闭液，请选择合适的封闭液。使用ab32034检测p27 KIP1时，不同封闭液封闭效果不同。Lane 1: 2% BSA；Lane 2: 5% BSA；Lane 3: 5% NFDM/TBST。抗体孵育抗体孵育通常包括一抗孵育和二抗孵育，一抗可特异性地和靶蛋白相互结合；二抗能辨认一抗的恒定区（具有物种特异性），具有放大信号的作用。在抗体孵育时需要特别关注以下小细节：在WB实验过程中，请避免干膜情况。请根据产品说明书选择合适的抗体工作浓度。如果不清楚给定的未纯化抗体样品的浓度，请参考表2。表2 抗体使用浓度参考表组织培养上清腹水全抗血清纯化的抗体WB1/1001/10001/5001g/ml浓度估计1-3mg/ml5-10mg/ml110mg/ml建议使用新鲜抗体，不建议抗体重复利用。抗体孵育时，膜尽量不要裁剪抗体孵育后充分洗涤，去除非特异性结合检测二抗通常带有标签，以用作检测。常见检测手段有化学发光和荧光标记等。在检测时需要特别关注以下小细节：化学发光检测显色底物的选择，现配现用，避光处理显色底物全覆盖在膜上，避免不均荧光检测溴酚蓝也会有产生荧光的倾向，最好让它离目的条带远一些以上就是 abcam 整理的在 WB 实验中需要注意的细节！不管你是做哪个靶点，这些技巧都是可以适用的！担心遗漏这些细节点的小伙伴也不要着急，点击图片下载我们为您准备的 WB 实验 check list，边做实验边检查，相信一定会获得满意的实验结果！
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蛋白质印迹（Western blot）实验方案| Abcam中文官网
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我们的 western blot 实验方案包含溶液、试剂、检测步骤和有用的链接，可指导您完成整个实验。2020 年 12 月 14 日审核Western blot 是一项通过凝胶电泳按照分子量大小分离蛋白，然后再利用特异性抗体识别这些蛋白的技术。免疫检测通常使用由硝酸纤维素或 PVDF（聚偏二氟乙烯）制成的膜。将凝胶紧贴膜放置，蛋白在电流作用下从凝胶迁移到膜上。然后利用目标靶点特异性抗体对膜做进一步处理，再通过二抗和检测试剂让膜显色。目录溶液与试剂：裂解缓冲液溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液样本裂解样本制备上样和跑胶蛋白转膜抗体染色相关链接网络研讨会记录查看下方的 western blot 实验方案视频。
查看更多实验方案视频，请单击访问我们的方案视频库。>> 打印完整的 western blot 实验方案>> 查看我们的 western blot 实验方案图如需提升 western blot 分析技能，请查看我们的免费 western blot 培训（可点播）。
溶液与试剂：裂解缓冲液这些缓冲液在 4 ℃ 下可保存数周，也可分装后在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。NP-40 缓冲液150 mM 氯化钠1.0% NP-40（可用 0.1% Triton X-100 代替）50 mM Tris-HCl，pH 8.0蛋白酶抑制剂RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀检测缓冲液）150 mM 氯化钠1% IGEPAL CA-6300.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）50 mM Tris-HCl，pH 8.0蛋白酶抑制剂Tris-HCl20 mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）蛋白酶抑制剂
溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液
Laemmli 2X缓冲液/上样缓冲液4% SDS10% 2-巯基乙醇20% 甘油0.004% 溴酚蓝0.125 M Tris-HCl测定 pH 值并将 pH 值调整至 6.8电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS）25mM Tris base（三羟甲基氨基甲烷游离碱）190mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3转膜缓冲液（湿转）25mM Tris base （三羟甲基氨基甲烷游离碱）190mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3对于大于 80 kDa 的蛋白，建议 SDS 终浓度为 0.1%。转膜缓冲液（半干转）48mM Tris base39mM 甘氨酸20% 甲醇0.04% SDS封闭缓冲液3–5% 牛奶或 BSA（牛血清白蛋白）加入 TBST 缓冲液。充分混合后过滤。不过滤可能会有斑点沉积，这种小暗点会在显色时影响实验结果。
样本裂解细胞培养裂解液的制备将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 个细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 烧瓶加 1 mL；每 5x106 个细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 烧瓶加 0.5 mL）。用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。或者，用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤细胞，然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中。4℃ 下持续振摇 30 分钟。放入微型离心机，在 4°C 下离心。您可能需要根据细胞类型改变离心力和离心时间；指南给出的参考标准是在 12,000 rpm 转速下离心 20 分钟，但须根据您的实验确定（白细胞所需的离心力很小）。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。组织裂解液的制备3.1 用干净器械解剖目标组织，最好在冰上，并且越快越好以防蛋白酶降解。将组织放入圆底离心管或 Eppendorf 管中，浸入液氮中“速冻”。样本在 -80°C 储存备用，或放在冰上立即匀浆。对于一块约 5 mg 的组织，向管中迅速加入约 300 μL 裂解液，并用电动匀浆器匀浆，2X 裂解液冲洗刀片两次，每次 200 μL，然后在 4℃ 下（例如将回旋振荡器放入冰箱）持续振摇 2 小时。裂解液的体积必须根据组织总量决定；蛋白提取物不宜过稀释，以免造成蛋白损失，并尽量减少样本体积，以便凝胶上样。最小浓度为 0.1 mg/mL，最佳浓度为 1-5 mg/mL。在微型离心机中 4℃ 下按照 12,000 rpm 的转速离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。样本制备取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。确定蛋白质的上样量，并添加等体积的 2X 稀释 Laemmli 样本缓冲液。我们建议使用以下方法对样本进行还原和变性，除非在线抗体数据表显示应使用非还原和非变性条件。对样本进行还原和变性时，将样本缓冲液中的细胞裂解液在 100°C 下煮沸 5 分钟。裂解液可等量分装并在 -20°C 下储存备用。上样和跑胶3.1 将等量的蛋白和分子量标志物上样至 SDS-PAGE 凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为 20-30 μg，纯化蛋白的上样量为 10-100 ng。3.2 在 100 V 下跑胶 1-2 小时。时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。建议使用还原型凝胶，除非抗体数据表推荐使用非还原性条件。凝胶百分比取决于目标蛋白的大小：蛋白大小凝胶百分比4–40 kDa20%12–45 kDa15%10-70 kDa12.5%15-100 kDa10%25-100 kDa8%也可以使用梯度凝胶。蛋白从凝胶转移到膜膜可以是硝酸纤维素，也可以是 PVDF。用甲醇活化 PVDF 1 分钟，并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。转膜时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查蛋白质转膜。转膜层的制备如下：
图 1.制备好的转膜层示例。
抗体染色
用封闭缓冲液在室温下封闭膜 1 小时或在 4°C 下封闭过夜。用适当稀释的一抗在封闭缓冲液中孵育膜。我们建议在 4°C 下过夜孵育；其他条件可以优化。用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜 1 小时。用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。产生信号时，请遵循试剂盒生产商的建议。除去多余的试剂，并用透明塑料膜覆盖膜。利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。
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查看更多 western blot 实验方案查看所有 Abcam 内参对照。示例内参对照：ab8227 beta actin
所有泳道：beta Actin 抗体 - 内参对照 (ab8227)，稀释度为 1/5000泳道 1：HeLa 全细胞提取物泳道 2：酵母细胞提取物泳道 3：小鼠脑组织裂解液查看我们可提供的阳性对照裂解液、封闭肽和阳性对照蛋白清单。查看蛋白质印迹中表现出色的 AbExcel 二抗。观看我们简单易懂的实验方案视频。实验方案由 Abcam 根据 Abcam 实验室使用 Abcam 试剂和产品开展的实验“按原样”提供；在其他条件下使用实验方案得出的结果可能会有所不同。网络研讨会记录Western blot 的目的在于按照分子量大小在凝胶上分离蛋白。然后将蛋白转移到膜上，从而使用抗体对蛋白进行检测。在含有还原剂（如 β-巯基乙醇）的样本缓冲液中，95 ℃ 下加热样本 5 到 10 分钟。这样可以让线性化蛋白带上与其大小成正比的负电荷。将凝胶放入电泳槽中并加入缓冲液，确保孔的顶部被缓冲液覆盖。所用凝胶的丙烯酰胺百分比取决于靶蛋白的分子量。将分子量标志物上样至第一泳道，然后将样本上样至相邻的孔中。所有样本均含有等量蛋白。所有样本完成上样后，添加电泳缓冲液，给电泳槽盖上盖子。打开电源，按照制造商的推荐设置凝胶槽中凝胶的电压。这时应该能够看到凝胶槽中有上升的气泡。跑胶，直到染料前沿充分移动至凝胶。下一阶段是将蛋白从凝胶转移到膜。膜通常由硝化纤维或 PVDF 制成。从凝胶槽中取出凝胶，并小心地将它从塑料盒中释放。切断孔和凝胶脚，并将凝胶放入转膜缓冲液中。将膜和凝胶夹在滤纸和海绵之间，制备转膜层。膜应靠近正极，凝胶应靠近负极。使用小滚筒去除凝胶和膜之间的气泡。夹住关闭的转膜箱，并将它浸入含有转膜缓冲液的转膜槽中。向外室加水，以保持系统冷却，并盖上盖子。打开电源，开始转移蛋白。时间和电压需要优化，请查看制造商的说明。现在蛋白已经从凝胶转移到硝酸纤维素膜上了，可以用抗体检测目标蛋白了。膜可以从盒中取出，现在应该可以看到分子量标志物了。如有需要，可以用丽春红 S 溶液对膜进行染色，从而确认蛋白质的转移。为了防止抗体发生非特异性结合，需要封闭膜。将封闭缓冲液倒在膜上，并置于摇床上轻轻摇动。通常情况下，需要使用 5% 牛奶或牛血清白蛋白（BSA）溶液在室温下孵育两小时或 4℃ 下孵育过夜。应优化封闭缓冲液的时间和类型，请查看您打算使用的一抗的数据表，了解详细信息。膜封闭后，去除封闭缓冲液，在同一溶液中加入稀释的一抗。与之前一样，置于摇床上孵育。通常会在室温下孵育一抗 1 小时或 4℃ 下孵育过夜。抗体浓度和孵育时间需要优化。如需任何指导，请查阅抗体数据表。倒出一抗，用洗涤缓冲液冲洗膜两次。随后在摇床洗涤膜 1 次，时长 15 分钟，再洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。洗涤缓冲液通常是含 0.1% 吐温 20 的 Tris 缓冲盐溶液（TBS）或磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）。倒掉洗涤缓冲液，在偶联二抗中孵育膜，二抗需先在封闭缓冲液中稀释。通常要在室温下孵育一小时，但抗体浓度和孵育时间需要优化。倒掉二抗，并按照上述步骤清洗膜。有几种不同的检测系统。如果二抗与酶偶联，则成像前，应在合适的底物中孵育膜。如果二抗是荧光偶联二抗，可以直接进入成像步骤。成像时使用 X 射线胶片或数字成像系统。将膜放入成像托盘中。将成像托盘放入成像系统。为了清楚地检测与目标蛋白相关的条带，可能需要优化曝光时间。
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电泳是根据分子的大小和电荷对其进行分离和分析。我们的电泳实验方案包括制备PAGE 凝胶和内参对照。 打印本实验方案。电泳可以是一维的（即一个方向）或二维的。一维电泳用于大多数常规蛋白质或核酸的分离。而二维蛋白电泳用于指纹鉴定（fingerprinting），经过实验设计与优化，可以高度准确地解析细胞中的所有蛋白。下面我们将介绍一维电泳技术。对于二维电泳实验方案，我们推荐参考《Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach》（Hames BD 和 Rickwood D 主编，实用方法系列，第 3 版。牛津大学出版社，1998 年）。制备聚丙烯酰胺电泳凝胶(PAGE)阳性对照分子量marker上样与跑胶内参对照搜索经WB应用检测的一抗
制备 PAGE 凝胶聚丙烯酰胺凝胶由两种化合物聚合而成的，丙烯酰胺和 N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（简称为 bis）。Bis 是凝胶的交联剂。聚合是通过添加过硫酸铵 (APS) 和 DMAP 或 TEMED 来启动的。这种凝胶是中性、亲水、由亚甲基交联的长链碳氢化合物的三维网状结构。分子在凝胶中的分离是由凝胶内形成的孔径的相对大小决定的。决定凝胶孔径的大小有两个因素：丙烯酰胺总量 (%T) 和交联剂的量 (%C)。当丙烯酰胺的总量增加时，孔径减小。就交联而言，5%C 时孔径最小。%C 的增加或减少，都会增加孔径。凝胶可以购买商业化成品，也可以在实验室中制备（在实验室手册中可以找到配方）。Abcam 实验室使用的是 Optiblot 系列凝胶。不管选择哪种方式，都要仔细选择凝胶的百分比，它决定了蛋白的迁移率和分离度。目标蛋白的分子量越小，丙烯酰胺/bis 的百分比越高。目标蛋白的分子量越大，丙烯酰胺/bis 的百分比越低。 参考以下简易指南，根据蛋白的分子量大小选择合适的凝胶百分比。当然，也可以选择使用梯度凝胶。蛋白的分子量大小e凝胶丙烯酰胺百分比4–40 kDa20%12–45 kDa15%10–70 kDa12.5%15–100 kDa10%25–200 kDa8%丙烯酰胺是一种强的累积神经毒素：应始终佩戴手套。按照制造商的说明将凝胶置于电泳槽中，并浸泡在迁移缓冲液中。阳性对照使用阳性对照可以确证实验方案的有效性和正确性，特别是当抗体识别的目标蛋白在样品中不存在时。在设计新实验时，我们强烈推荐使用阳性对照；这会使您对实验方案与结果更有信心。分子量marker分子量 marker 使您能够确定蛋白的分子量大小，并且监控跑胶。市面上有各种分子量marker可供选择。我们提供以下分子量marker：分子量marker (ab48854)Prism 蛋白 Ladder (10-175 kDa) (ab115832)Prism Ultra 蛋白 Ladder (10-180 kDa) (ab116027)Prism Ultra 蛋白 Ladder (10-245 kDa) (ab116028)Prism Ultra 蛋白 Ladder (3.5-245 kDa) (ab116029)上样与跑胶使用专用的凝胶上样枪头或微型注射器将样品完整的加入孔中。注意不要接触到孔的底部，否则会产生扭曲的条带。上样量不要过度。如果样品溢入相邻的加样孔中，会影响实验结果。每孔加入 20-40 µg 总蛋白。凝胶应该浸没在含有 SDS 的迁移缓冲液中，非变性凝胶电泳除外。标准的 PAGE 迁移缓冲液（也称作电泳缓冲液）是 1x Tris-甘氨酸：25 mM Tris base190 mM 甘氨酸0.1% SDSpH 约为8.3按照制造商的推荐时间跑胶；不同机器的时间各不相同（根据电压，跑胶 1 小时至过夜不等）。当染料（迁移的最前沿）到达凝胶底部时，关闭电源。此时蛋白将缓慢地从凝胶中洗脱出来，因此凝胶不要保存在溶液中；应立刻进行转膜。内参对照内参对照是用来确认凝胶中加入的样品是否等量，特别是在比较不同样品中蛋白的表达水平时。它们也可以用于检查样品是否从凝胶转移到膜上。甚至在还没上样或转膜时，也可以使用内参对照来定量每条泳道中的总蛋白。如需要发表文章，使用内参对照至关重要。访问我们的内参对照指南。 下表包含常用的内参对照：内参对照样品类型分子量注意事项Vinculin全细胞125 kDaCyclophilin全细胞24 kDaGAPDH全细胞35 kDa一些生理因素（如缺氧和糖尿病）会增加特定细胞类型中 GAPDH 的表达水平。Cofilin 全细胞细胞核细胞膜细胞骨架19 kDaAlpha tubulin全细胞细胞骨架50 kDa由于抗菌剂的抗性，微管蛋白的表达水平可能会有所不同 (Sangrajang S et al., 1998; Prasad V et al., 2000)。Beta tubulin全细胞细胞骨架50 kDa由于抗菌剂的抗性，微管蛋白的表达水平可能会有所不同(Sangrajang S et al., 1998; Prasad V et al., 2000)。Actin全细胞细胞骨架42 kDaBeta actin全细胞细胞骨架40 kDa不适用于骨骼肌样品。细胞生长条件的改变以及与细胞外基质成分的相互作用可能会改变肌动蛋白的合成 (Farmer et al., 1983)。VDAC1/Porin线粒体30 kDaCOX IV线粒体20 kDa许多蛋白的分子量与 COX IV 相近。HSP60线粒体细胞膜60 kDaLamin B1细胞核66 kDa不适用于去除了核膜的样品。HDAC1细胞核55 kDaYY1细胞核45 kDaTBP细胞核35 kDa不适用于去除了 DNA 的样品。PCNA细胞核30 kDaCdk4细胞核细胞膜34 kDaNa-K ATPase细胞膜110 kDaTransferrin血清75 kDa
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五分钟学会WB（western blotting）实验 - 知乎
五分钟学会WB（western blotting）实验 - 知乎切换模式写文章登录/注册五分钟学会WB（western blotting）实验一起实验网WB，(Western blotting),中文名蛋白质印迹，又称免疫印迹(immunoblotting)，用于检测特异性目的基因表达的蛋白成分。比如说你要用大肠或者酵母表达某种目的蛋白，把基因克隆到宿主后，要检测的目的蛋白的表达就可以用western blot。总体来说有5个步骤，蛋白电泳，转膜，封闭，加抗体，以及检测。1.蛋白电泳—蛋白根据分子量大小分开SDS（负电）-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis分子量大的跑得慢，在胶的顶部，分子量小的跑得快，在胶的底部（电泳速度与分子量大小、电荷量和蛋白结构有关）蛋白上样缓冲液：SDS，可使得蛋白裹上足量的负电荷，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异；DTT还原剂，可打开巯基维持单链的线性结构，并且通过煮沸仅保留一级结构，消除了结构差异；甘油，可起沉降作用使得混合的样本沉降到加样孔底部，不会逸散至加样孔以外；溴酚蓝，小分子蓝色物质，在最下面的位置，有指示作用：当它刚好跑出最下方玻璃板时，就可以结束电泳了。2.转膜（膜与蛋白有高度亲和的能力）因为蛋白位于胶的内部，所以要将蛋白从胶内部转移到膜表面，使抗体更容易和蛋白结合。常用的两种：NC硝酸纤维素膜和PVDF（聚偏氟乙烯）膜电场垂直于凝胶和膜：所以凝胶中的蛋白（带负电）向紧贴着凝胶的膜上转移，最终吸附在膜的表面滤纸：维持transfer buffer稳定流动。里面会加甲醇：当蛋白从凝胶中出来后，使蛋白与SDS分离，阻止其继续移动，从而更好地与膜结合。3.封闭封闭膜的空白结合位点，防止添加的抗体吸附在除目标蛋白外的膜上的其他位置（且很难洗掉），否则最终会显示出非特异性条带、杂带、高背景等，不仅浪费抗体，还影响判断。脱脂牛奶或BSA胎牛血清。虽然也会在一定程度上吸附到目标蛋白上，但都属于非特异性的结合，很容易在后面的漂洗中消除4.抗原抗体免疫反应1）一般先加一抗：与蛋白特异性结合，常用的孵育时间和温度是4℃摇床过夜赋予（温度适宜，分子运动温和）。洗膜：未结合一抗洗掉。2）二抗：被HRP辣根过氧化物酶标记（可与发光底物相结合）的抗体：可结合多个二抗，放大信号。同样也是孵育后洗膜5.蛋白检测资料来源https://www.bilibili.com/video/BV1GA411n7bp?spm_id_from=333.999.0.0发布于 2022-08-10 13:55韦士敦大学（Western University）生物实验wb实验赞同 423 条评论分享喜欢收藏申请
最全Western blot经验大盘点，WB有这一篇就够了 - 知乎
最全Western blot经验大盘点，WB有这一篇就够了 - 知乎首发于生物科研切换模式写文章登录/注册最全Western blot经验大盘点，WB有这一篇就够了myhalic生物科研 课题设计 实验检测Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验，却蕴含了很多知识，可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤，却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树，后人乘凉，现在小鱼就把各位前辈做WB的各种经验总结起来，希望对大家能有所帮助。WB的基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。两种的方法的优缺点比较：WB的一般流程：1蛋白的提取好的蛋白是WB成功的一半经验总结：1：合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2：尽量除去核酸，多糖，脂类等干扰分子3：提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。4：蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。5：蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。2电泳凝胶浓度与蛋白分离范围经验总结：1：上样时：根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。2：胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。3：为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参（一般指由管家基因编码表达的蛋白）。4：为了确保western blot结果的准确性和特异性，设置合适正确的对照是必不可少，一般需要设置的对照如下——阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性；内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。3转膜（western blot成败的关键）用于western blot的杂交膜主要有两种：NC膜和PVDF膜，可依据目的蛋白与膜的结合能力及膜的孔径来挑选不同的转移膜。两个膜之间的比较：转膜方法：分为两种湿转法和半干法经验总结：1：胶在负极，膜靠近正极；滤纸不要大过膜，防止短路；2：夹好膜和凝胶后，确定在凝胶、膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。3：注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。4：转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常 会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。5：对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的>50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。4免疫印迹经验总结：1：常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液（生物试剂公司提供）。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5%BSA会比5%牛奶的效果好。2：选择抗体时，一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。5WB结果定量分析WB做完后，有时需要对结果进行定量。然而最备受推崇的定量分析软件Quantiy One软件因其高昂的售价令很多人望而却步，但除了该软件外还有一个比较简单的图像处理软件ImageJ可以很方便的进行灰度和密度分析。ImageJ的软件界面1.ImageJ对WB条带进行灰度分析1）File|Open打开WB结果图片2）图片类型设置：Image|Type|8bit3）去除图片背景：Process|Subtract Background在Subtract Background窗口按照以下条件进行设置：4）设置定量参数：Analyze |SetMeasurements,点击Area，Mean Gray Value及Integrated Density5）设置单位:Analyze|SetScale,在“unit of length”的方框里输入“pixels”6）将图片转换成亮带，Edit|Invert7）选择Freehand Selection,尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值8）复制数据IntDen进行分析2. Image J 对WB条带进行密度分析1）步骤同前，File|Open打开WB结果图片2）如果条带不正，需修正Image transform rotate调节angle值，直到条带水平为止3）选中矩形选项，圈中第一个条带，AnalyzeGels Select Firstlane（快捷键Ctrl +1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，Analyze Gels Select Second Lane（快捷键Ctrl+2）,最后Analyze GelPlotlanes选中直线工具，将开口的波峰关闭选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值即为相对密度。6WB疑难杂症另附前辈们11条“济世”经验1、抽提出某个蛋白第一次检测，因为不知道表达量咋样，可以减少裂解液（这样蛋白浓度高一些），上样量加大，抗体浓度大一点，增加出结果的几率，否则出不来结果不知道是因为蛋白量太小还是抗体等其他条件影响，有结果后再根据条带的亮度调整各种试剂的用量。2、同时检测两种蛋白或两个样本的同种蛋白时，蛋白抽提出来后测浓度，调整每个孔的蛋白上样量一致，通常做法时，做标准曲线，再计算待测蛋白的浓度，下面是偷懒的办法：直接用酶标仪测这两个样品的吸光度，根据吸光度值将两个样品的蛋白浓度调整成一致后上样。吸光度跟蛋白浓度成正比，没必要一定要测量出具体浓度，而且只要使我研究的一对蛋白浓度调整一样（对照组，处理组），没必要将不同样本的各组均调节成一个浓度。（懒人有懒人的活法，但是我懒得有原则）3、科研小白注意黑胶白膜，黑胶白膜，黑胶白膜，重要的事情说三遍。转膜是最好是将膜放在下面，胶放上面，否则会有镜像效果，等转完膜后拿出膜时，把膜反过来时，上样顺序会左右颠倒，因为胶无正反，膜有正反。4、marker尽量不要放在中间，放在两边作为顺序的标记，或者，在胶剥离出来后和PVDF膜的一角剪掉一小块作为标记。（翻过来翻过去，咦，记不得哪边是哪边了）5、封闭的时间可以延长问题不大，但是跑胶电泳时不能将胶长时间放在仪器里面，而应该放在转膜液里固定（里面有甲醛，可固定蛋白），如果在没有电流下蛋白一直在胶内 ，蛋白未被固定，会扩散，转完膜后条带难看。（甲醛是什么呀，就是大家经常报道的新装修的房子甲醛超标，所以实验狗不容易呀，每天跟这些有毒的东西打交道。）6、封闭不一定要使用脱脂牛奶，3%BSA也可以，做磷酸化蛋白是尽量使用BSA可以降低背景。一般的实验还是用便宜的脱脂牛奶。7、如果一次性需要检测多个蛋白，电泳后可根据marker（即分子量）将膜剪开，分别不同的抗体孵育，可一次检测多个蛋白；当两个蛋白分子量很相近PVDF膜无法剪开时，可先曝表达弱的蛋白，再用抗体洗脱液将已结合的一抗、二抗洗去，这样一张印迹膜可以多次使用，再曝表达强的蛋白，但注意的是此种方法可由于剧烈处理丢失某些表位。8、买一个抗体孵育槽可以节省抗体的使用量，每个小槽可以孵一张膜。（土豪请忽略这一条，哪里买，问淘宝）9、内参因为使用量大，市面上有带HRP的内参出售（言外之意就是一抗上面就带HRP，就不用孵二抗了），前几次摸条件时，用带HRP的内参，可以直接一抗后先曝下内参，如果内参不齐，目的基因暂时就不用孵育了，等调节蛋白上样量一致后再去检测目的基因。10、抽提蛋白时全程都要在冰上， 因为加了细胞裂解液后细胞被破坏，细胞内的各种酶被释放，如果不在冰上操作，蛋白容易降解，如果开始抽提蛋白，建议一次性操作到加上loading buffer煮蛋白变性的步骤，煮蛋白的将蛋白变性，后不易降解，如果要长期保存，放到-20度。11、频繁做WB时，可以一次可以多配几块电泳胶，running buffer 4度保存，省的每次配胶。来源：达人学社发布于 2018-10-19 17:15经验赞同 33512 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录生物科研一群可爱的科研团队,科研生活,经
western blot 的原理是什么？ - 知乎
western blot 的原理是什么？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册实验分子生物学医学生物实验生物western blot 的原理是什么？关注者257被浏览534,143关注问题写回答邀请回答好问题 14添加评论分享31 个回答默认排序酸菜科研等 2 个话题下的优秀答主 关注Western blot，中文为蛋白质免疫印迹试验，简单来说是抗原抗体特异性结合。电泳分离后的蛋白转移到固相载体PVDF膜上，以共价键的形式吸附蛋白质，并作为抗原结合特异性抗体。二抗作为显色标记，经过底物显色反应组织和细胞中蛋白的表达情况。蛋白提取1. 组织蛋白提取相对于细胞而言，组织蛋白的提取对技术和外界环境要求会更高一些。因为我们养的细胞很多是根据具体实验选择的特定细胞，而组织大多是为了丰富体内实验的各种蛋白的混合体，目的蛋白的含量并不一定充分，而且其中还包含着丰富的蛋白酶、血液或者脂肪等干扰因素。所以个人认为，提取组织蛋白一定要做预实验，这是很有必要的。可以摸清楚每次应该取多少重量的组织，什么样的离心条件可以去除血液和脂肪的干扰。比如像心脏、脾这类血液较多的组织，剪成米粒大小的小块儿后，加入适量PBS(PBS:PMSF=100:1，PMSF为苯甲基磺酰氟，蛋白酶抑制剂，30min内会降解一半，因此每次提取蛋白要加新鲜的PMSF)，7500g离心力，离心5分钟，去上清。如果感觉血液还是很多，可以重复上述步骤数次。蛋白提取的全程要在低温环境下进行，以防止蛋白降解。30mg的组织对应500ul的RIPA裂解液（RIPA全称为Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA:PMSF=100:1），置于冰上，使用研磨棒或电动组织研磨器充分研磨30分钟，再置于冰上静止30分钟。在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。2.细胞蛋白提取细胞蛋白的提取相对来说耗时会少很多，只是在贴壁细胞和悬浮细胞的处理方式上略有不同。对于贴壁细胞而言，去除培养基后，用无菌预冷的PBS清洗3次，每次3分钟。对于像6cm的培养皿，我习惯每次加100ul的RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1），转动培养皿，让裂解液接触到整个皿面。之后用细胞刮刀将皿里的细胞刮刀一侧，冰上静置15分钟后，在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。对于悬浮细胞而言，吸出培养皿中的培养基，按照传代时离心力大小和时间进行离心。离心结束后，小心的倒掉上清，加入100ul的RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1），冰上静置15分钟后，在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。3.测定蛋白浓度蛋白浓度的测定一般选用BCA工作液（bicinchoninic acid），BCA工作液作为一种稳定的水溶性复合物，可以与二价铜离子结合，产生紫色复合物。562nm波长条件下测定吸光度，制作标准曲线，吸光度与蛋白浓度成正比。4.蛋白变性根据蛋白的体积，计算加入多少体积的1*loading buffer，煮沸5分钟即可。Loading buffer中主要含有溴酚蓝、二甲苯氰和甘油。前两者起到指示作用，甘油起到沉降蛋白的作用，以防加样时蛋白飘出。电泳1.制胶根据目的蛋白的分子量大小选择不同浓度的分离胶，8%、12%和15%三种浓度的分离胶就完全可以搞定日常蛋白的测定。一般测定100kDa分子量以上的蛋白可选择8%浓度的分离胶；测定20kDa分子量以下的蛋白可选择15%浓度的分离胶，中间的分子量可选用12%浓度的分离胶。有的时候蛋白跑不出来，其实未必是分离胶浓度选的不好，也有可能是marker的问题。marker起到的是蛋白分子量指示剂作用，但是要根据蛋白分子量选择合适的marker。一般的marker分子量范围在10-130kDa之间，都可以满足正常蛋白的需要。但有些分子量范围较广的marker，比如说6-250kDa，虽然说它范围很广，可中间的蛋白分子量并没有区分的很细，只适用于大分子或小分子蛋白，而对于30-70 kDa的蛋白并不是很适用。2. 电泳条件个人使用的条件一直是80V，300mA跑浓缩胶，120V，300mA跑分离胶，恒压电泳。当然了，这个电泳条件不是固定的，也有人选择恒流跑电泳。个人认为恒流和恒压对电泳的效果影响没有什么区别。因为配胶的成分中SDS起到的作用是破坏蛋白质分子和其它物质分子之间的非共价键。解聚后的蛋白质分子与SDS形成的复合物带有负电荷，远远超过蛋白质本身的电荷量，所以就不存在不同蛋白质分子之间的电荷量不同造成的影响了，恒压或恒流都只是起到推动作用。至于浓缩胶和分离胶的条件不同，我想这一点大家应该都很清楚了。浓缩胶中的孔隙较大，起到的作用是为了让蛋白质混合物在进入分离胶之前都到达同一起跑线，以便在分离胶中更好的分开，因此一定要充分跑完浓缩胶之后再调电压。转膜转膜分为湿转和干转。湿转就是把三明治结构放在转膜液中进行；干转，其实应该是半干转，虽然不放在转膜液中进行，但是滤纸也要事先泡过转膜液。有人说，湿转主要用大分子蛋白质转膜，半干转主要用于小分子蛋白质转膜，但是个人认为湿转就完全可以搞定大小所有分子量的蛋白，而且从转膜稳定率来说要好于半干转。所以个人习惯于用湿转。一般情况下的转膜条件是220V，300mA，转膜时间是1小时20分钟。对于10-180kDa分子量的蛋白，这个条件是完全可以的。虽然网上有很多人说小分子量的蛋白需要缩短转膜时间，或者改变电压电流，但是本人试过用这个条件转8kDa的蛋白质，一样没有问题。相反的，我缩短了转膜时间，或者改成了100V，300mA的转膜条件，转膜的效果反而不好。所以个人认为，转膜效果的好坏除了要考虑机器本身设定的条件外，还需要考虑一下其他因素。有很多新手用完转膜液忘记放回4度冰箱，时间久了，转膜液的离子成分就会发生改变，影响转膜效果；或者是滤纸使用太久了，也会影响转膜效果；又或者是要研究的蛋白自身性质决定的。Western blot并不适用于所有的蛋白，对于检测一些分泌型的蛋白，ELISA会更适合，所以也并不是说蛋白实验一定要用Western blot。发光选用ECL发光液发光。ECL发光液分为A液和B液，按照1:1的条件混合配制。洗膜结束后，倒出多余的TBST，但是也要在洗膜的塑料盘中留有一些，防止PVDF膜干掉。基本上1ml的工作液可以覆盖10cm3，发光的效果与发光液的新鲜程度有关，所以要现用现配。ECL的发光原理是：发光剂中的鲁米诺被过氧化氢和HRP氧化，产生荧光，整个发光过程被增强剂增强了发光效果，可以将灵敏度提高到1000-100000倍，但是也会遇到猝灭的情况，除了成像机器老化的原因外，也与发光液的新鲜程度和一抗二抗的浓度有关。质量好的发光液配合着合适的一抗二抗浓度，才能快速完美的发光。小于1分钟的发光时间固然是我们所向往的，但是碰上信号低的蛋白，我们也要想尽办法让它们显示出结果。对于信号弱的蛋白条带，我们可以手动调整发光时间少一些，比如说10sec，快速曝光比延长曝光时间的显影效果更好。用各种软件处理分析蛋白条带1.Photoshop CS6PS软件在后期投稿整理图片方面会有很大作用，这里我想说的是利用PS改变条带的对比度，减少后续利用Image j对蛋白灰度值进行测定时的干扰。正常机器发光之后的图片，背景都会泛蓝，我们可以选择PS软件中，图像-调整-去色，把条带背景统一调成灰色后再测灰度值。2.ImageJ利用Image j测量蛋白灰度值的方法，我想大家都很熟悉了，我就不详细的列出每一步了。这里想提到一点，BCA测出的蛋白浓度有时会存在一定的误差。我们在测蛋白标准曲线时，得出的R值肯定是9越多越准确，但是实验过程中，我们往往只有一或两个9，导致内参发出来的效果也是各组略有差异。为了追求完美，我们可以通过内参的灰度值进行作比，以一个组的蛋白浓度为定量，适当调整其他各组上样量即可。知乎专属福利；助大家一臂之力、我为大家准备了一份基础实验protocol,细胞侵袭、细胞凋亡、细胞黏着、细胞周期等，不仅有细胞培养相关实验，还有包括不同研究水平实验技术Protocol，不同实验方法全流程，WB实验流程、注意事项、数据处理及写作、IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等相关实验的详细步骤，全都是经过前辈们无数次验证过的，希望对大家的实验有帮助。点击下方链接可扫码添加酸菜老师助手，知乎私信不回问题：中国临床医生科研成长平台；小助手会免费赠大家一门医学SCI从入门到精通学习营，添加即送！编辑于 2023-04-14 17:22赞同 41318 条评论分享收藏喜欢收起科研根号三实验室多年经验分享 关注刚好最近做完了实验，实验室要带师弟师妹做western blot实验了，western blot实验相关的经验总结写了几个晚上，这里一起分享给大家，刚入门的同学可以多看看~Western Blotting技术是将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体（例如纤维素薄膜）上，利用抗原抗 体反应来检测目的蛋白的方法。如果整个实验过程中每一个实验步骤都能成功，就可以获得很好的实验结果。 除了对Western Blotting实验操作流程，对各步骤的操作方法和注意事项进行了通俗易懂的说明和介绍。 这里也会对实验操作中遇到的各种问题给出解决方法。Western blot实验教程大全，里面有实验的视频操作教程~额外分享：有需要的小伙伴可以自行下载~免费，亲测安装！56个科研人必装软件安装包 （11月更新）实验数据/图片处理+文献管理+科研绘图+写作翻译+统计分析+办公常用链接：https://pan.baidu.com/s/1JkjM67dHoKsY3K5AkLGrTg?pwd=6868 提取码：6868 一、Western Blotting检测的操作方法和注意事项觉得有用的话记得小手双击屏幕点个赞同❥(^_-)二、Western Blotting 实验问题及解决方案问题1：有污渍或斑点，整体背景普遍偏高问题2：出现白色条带问题3：出现非特异性条带问题4：信号弱或无信号Western BLoT Immuno Booster（制品code T7111A）可有效改善结果。 Western BLoT Rapid Detect v2.0（制品code T7122A） 可有效改善结果。 问题5：膜上部分无信号问题6：条带扩散三、Western Blot中结果条带的各种稀奇古怪结果图解析1. 啥也没有原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。经验：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。2. 高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。3. 非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。4. 条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。5. 条带中间出现白色（反白）原因：中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了解决办法：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。经验：如果你足够迅速，可以在中间部位底物消耗之前就把X光片给定影出来，但是时间很难把握，建议还是从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度入手。6. 出现黑点和黑斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合解决办法：封闭牛奶一定要纯，封闭结束之后要洗经验：我们常常是等到要封闭的时候发现没有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的时候往往不管是否已经完全溶解，如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上，会导致很多不溶性颗粒附着在膜上，这就会导致发光时候膜上的黑点。所以牛奶溶解之后，最好静止一下，然后轻轻地吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束之后一定要洗三遍之后再加一抗。7. 条带拖尾原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议5min*5次，不要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮，真正的抗原抗体的结合是通过这种方式洗不掉的。8. 出现重影原因：荧光强度比较高，在压片时，放好之后不小心又轻微移动了一段距离解决办法：X光片放上去之后，就不要动了，即使放歪了也没关系。经验：有的时候出现重新刚好在上下位置，并且重影会相对弱一些，不要误以为抗体识别了该蛋白的另外一种异构形式。9. 出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干经验：在封闭的时候，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。注意与高背景区别。10. 某个条带变形原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。经验：很多实验室中使用的不是最新的设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。11. 条带呈哑铃状原因：配置胶有问题解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用经验：出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一，不知道大家有没有出现如下的配胶情况，下图中示意拔完梳子之后的结果，如果你拔完梳子之后出现图中下面部分的样子，多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。12. 最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均一解决办法：换用新的电泳槽； 不使用两边的两孔经验：一般我们使用的是10孔的的胶，如果你上样刚好10个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。13. 其他问题（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。14. 电泳过程中出现现象及问题（1）整个条带呈 “ ︶ ” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。（2）整个条带呈“ ︵ ”： 凝胶左右两头没有凝固好（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。有时间再把一些经验分享给大家，今天就先到这里~点个赞同，祝你实验顺风顺水~推荐内容绝密！2023年国自然立项清单表可下载（生命科学部+医学科学部），附往年1000+份中标标书！如何查看国家自然科学基金的的摘要和下载结题报告？ 有哪些好用的zotero插件?有什么适合药学/生物方向科研小白的简单易学的科研绘图工具？有没有什么很好的科研作图软件？顶级图像分析软件，Image J、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定！ NoteExpress和EndNote相比哪一个更好用？（附安装包）2023年更新！EndNote X9永久激活版本（序列号激活），最稳定，可汉化！写的太全了，Endnote 插入文献以及调整参考文献格式，这是知乎上最好的教程！太牛了！Zlibrary回归，这里有最稳定的访问指南！western blot是为了什么？如何学习和记忆细胞信号通路？最值得推荐装！GraphPad Prism 9.3 ，功能更多！SPSS 27 安装激活，授权日期到期时间2037年编辑于 2023-12-19 15:33赞同 110添加评论分享收藏喜欢
蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)- Western Blot 详解（原理、试剂、步骤及问题解答）-丁香实验
疫印迹(Western Blot，WB)- Western Blot 详解（原理、试剂、步骤及问题解答）-丁香实验48小时，有问必答丁香实验，轻松科研已收录 10000+ 实验48小时，有问必答丁香实验，轻松科研已收录 10000+ 实验48小时，有问必答登录提问提问我要登录｜免费注册丁香通首页|蛋白质实验|蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)| Western Blot 详解（原理、试剂、步骤及问题解答）点赞收藏分享 Western Blot 详解（原理、试剂、步骤及问题解答）相关实验：蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)最新修订时间：2023-07-20合作专家 | 孙齐博士生理学 首都医科大学简介Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
原理与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，「探针」是抗体，「显色」用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。材料与仪器
【试剂】
PBS、RIPA 裂解液、ddH2O、loading buffer、甲醇、抗体等；
【器材】
EP管、PVDF 膜、-20℃ 低温冰箱、匀浆器、高速离心机、电泳转移装置；
步骤一、蛋白样品准备：
1、以 6 孔板为例，先吸尽培养基，1xPBS 漂洗一下残留培养基（手动轻轻晃几下即可）后，加入预先配置好的含有终浓度 1mM PMSF/PI（检测磷酸化，可以加入 Na3VO4，NaF）的 RIPA 裂解液 500ul（RIPA 相对温和，适合 Co-IP；对于一般 WB 裂解，或对膜/核蛋白 WB，可以加入含有去垢剂 0.1% SDS 和脱氧胆酸钠的细胞裂解液，增加裂解效果）。
2、加好后用细胞刮（或枪头吹打）将细胞刮离孔底，吸回细胞裂解物至 EP 管中，4℃ 裂解 0.5-3 hour，可置于冰箱内旋转机器上使样品充分混匀裂解；
裂解完成后，12000rpm 4℃ 离心 10min，吸回上清，在吸回的上清中加入等体积的 2X loading（或 4X）并混匀，再将样品于 95℃ 变性 15min，变性结束后，样品可用于 SDS-PAGE 电泳。样品冻存于 -20℃ 或 -80℃。
3、制备组织样品时，按 0.1g 组织用 1ml 裂解液的比例在匀浆器中对组织进行研磨裂解，研磨充分后，将匀浆液吸至 EP 管中，至于冰箱内旋转机器上使样品充分混匀裂解 0.5-3 hour；
裂解完成后，12000rpm 4℃ 离心 10min，吸回上清，后续处理方法同细胞样品。
二、制胶及电泳：
用于制胶的玻璃板注意使用前清洗干净并晾干；注意玻璃板与胶接触的一面是否有划痕，尤其是下边缘破损，划痕可能导致电泳过程中出现漏样。
1、胶的配方：
配置合适浓度的分离胶，在胶板下层注入分离胶后，向胶板内轻轻注入 ddH2O 或异丙醇起到液封的作用，促进分离胶凝固；约 20min 分离胶即可凝固，可以倾去用于液封的 ddH2O，并倾斜放置胶板一会，让残余的 ddH2O 汇聚到一起后方便用滤纸吸尽；将胶板放平后继续配置浓缩胶，将浓缩胶注入胶板中，至薄玻璃板的上缘即可，尽量不要产生气泡，然后轻轻插入梳子即可；胶约 20min 后即可凝固使用。
2、电泳缓冲液为 Tris-Glycine-0.1%SDS 缓冲液。小分子蛋白（<15kD），建议用 Tris-Tricine，可以让条带压得更细。
3、100V 电泳，并根据实验需求及时终止电泳。一般浓缩胶电流小于分离胶电流。
提前配置转膜缓冲液并预冷备用（赶跑气泡）。转膜缓冲液为含有20%（v/v）甲醇（或等体积乙醇）的Tris-glycine溶液。
三、转膜：
1、先从胶板中将胶取出，根据具体实验需要确定是否取出浓缩胶部分，将胶在转膜缓冲液中浸泡 10min；裁剪与胶大小一致的 PVDF 膜和滤纸（统一：PVDF 膜 5.5X8.5 cm，滤纸 7X9 cm），PVDF 膜先用甲醇浸润 1min，再转入转膜缓冲液中浸泡 10min；
2、转膜时，转膜用的夹子黑色面在下，然后依次放：转膜用海绵垫，湿润的三层薄滤纸，蛋白胶，PVDF 膜，湿润的三层薄滤纸，转膜用的海绵垫；在放 PVDF 膜之前，先在蛋白胶上加少量的转膜缓冲液，放膜时将膜的一侧边缘与胶对齐后，膜会被溶液慢慢吸到胶上去，这样可以避免产生气泡；然后将夹子夹紧后放置到转膜槽内，注意夹子的黑色面要靠近转膜槽的黑色面，转膜槽电源接头处的颜色要与外面塑料槽标记的颜色匹配，防止正负电极搞错。
如果使用 NC 膜，则略去用甲醇浸泡的步骤，其余步骤不变。
3、转膜条件：100V，2h，冰浴（大分子蛋白可以增加到 3h）。
4、转膜完成后，可使用丽春红对膜进行染色，确定转膜是否成功。
四、封闭及抗体孵育：
1、封闭使用含有 5% 脱脂奶粉的 1xTBS（pH7.4），室温 1h，于摇床上进行；一抗孵育在 4℃ 冰箱的摇床上进行，孵育过夜，抗体稀释于含有 2% 脱脂奶粉的 0.1% Tween/TBS（pH7.4）中（为防止回收抗体变质，孵育前需添加 0.02% 的 NaN3）。孵育结束后，回收一抗储存于 4℃；用 1xTBST (0.1%Tween/TBS) 洗膜，10min/次，共洗 3 次。
2、二抗稀释（1:5000）于含有 2% 脱脂奶粉的(0.1%Tween/TBS)（pH7.4）中（HRP二抗不能添加 NaN3），于摇床上室温孵育 1h；孵育完成后，用 1xTBST 洗膜，10min/次，共洗 3 次。
五、显色及压片：
1、在干净的塑料膜上加适量的显色底物，然后将膜正面对着底物，让膜贴上去，室温静置 1-2min 后可到暗室压片；压片时需要根据荧光强弱选择适当的曝光时间。初学者起始 1min，然后根据黑暗中是否看到荧光，直接压 >5min 或快速几秒。以曝光时间 30s 为例，将膜正面（右上角折角作为记号）向上至于压片盒中，将 x 光片放到膜上，关紧压片盒，计时 30s，然后打开压片盒取出 x 光片，先在显影液中浸润 1min 后再在 ddH2O 中漂洗 10s，最后在定影液中浸润 1min 即可。可根据 X 光片上的条带强弱情况，具体再选择合适的曝光时间。为了充分利用胶片，建议把膜不要放正中间，这样可以一张胶片压多个时间点。
2、对荧光强度特别强的膜，可以把膜翻过来，从膜背面压片。或快速用手按紧胶片即刻拿走冲片。或同时压两张胶片。或等待一段时间再压片。新手不建议一次检测多张膜。
原则: 强信号和弱信号兼顾。
3、对荧光强度特别弱的膜，可以使用超级灵敏底物，动作紧凑，不要浪费信号。
4、压片完成后，及时标记 marker，做好记录，并且保持 PVDF 湿润，可以在 TBS 中 4℃ 暂时保存。
六、Reprobe：
压片完成后，需要对膜重新进行别的抗体的检测时，先用 1xTBST 洗膜 10min，在合适的容器内用 strip buffer 处理 20min，最后用 1xTBS 再洗 10min，膜即可进行重新的封闭及抗体孵育。
注意事项常用 buffer 配制：
1）Cell Lysis Buffer:
150 mMNaCl
10 mM EDTA
1% Triton X-100
0.1% SDS
1% Na-deoxycholate
PIC/0.25 mM PMSF
in 50 mMTris-HCl pH 8.0
检测磷酸化：可以添加 Na3VO4: 1 mM ; NaF: 1 mM 或磷酸酶抑制剂 Cocktail
2）SDS-PAGE stock solution
(1) Monomer Solution (30%T 2.7%CBis)(4℃)
Acrylamide 58.4 g
Bis 1.6 g
d2H2O to 200 ml
(2) Separating Gel Buffer (1.5M Tris-HCl pH 8.8)
Tris 36.3 g
d2H2O to 200 ml
(3) Stacking Gel Buffer (0.5M Tris-HCl pH 6.8)
Tris 3 g
d2H2O to 50 ml
(4)Samle Buffer
Tris-HCl pH6.8 (Solution(3)) 0.25ml
SDS(Solution(4)) 0.4 ml
Glycerol 0.2 ml
2-mercaptoethanol 0.1 ml
40mg/ml BPB 0.05ml
-------------------------------
total: 1 ml
(5) 10x Running buffer pH 8.3
Tris 30 g
Glycine 144 g
SDS 10 g
d2H2O to 1000 ml
（6）Transfer Buffer (25mM Tris, 192mM Glycine, pH 8.3 ):
Tris 3.03 g
Gly 14.4 g
甲醇或乙醇 200 ml
add d2H2O to 1000ml
（7）Ponceau S solution (0.5% Ponceau S dissolved in 2.5% HOAc) .
e.g. 50ml : 0.25g Ponceau S / 1.25 ml HOAc / 48.75 ml d2H2O)
（8）温和型 Strip buffer (100 ml):
1.5g Glycine/0.1g SDS/1ml Tween-20 in 100 ml H2O, PH2.2,常温反应
剧烈型 strip buffer(100ml):
687ul 2-ME/20ml 10%SDS/12.5ml Buffer3 (stacking buffer)，50C 反应常见问题Western blot 实验常见的问题：
（1）参考书推荐
A. 对初学者看什么资料比较好？
解答：《抗体技术实验指南》和 Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow，david lane）两本书不错。
（2）针对样品的常见问题
A. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot，提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到 120 μg，换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查 Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
B. 细胞水平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋白够 Western Blot？
解答：一般地 5 × 106 就足够了。
C. 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白吗，这样对 Western Blot 有无影响?
解答：能，没有问题，我们做过。
D. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗？
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
E. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性。
F. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到 1 微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加 5~10％ 甲醇。
G. 想分离的蛋白是分子量 260 kDa 的，SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作 Western Blot 吗？
解答：260 kDa 的蛋白不好做，分离胶用 6％，Stacking Gel 3.5％。
H. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载 30％ 是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试 1.5 mm 的 comb。
I. 蛋白变性后可以存放多久？
解答：-80 ℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉 (也是被酶水解了)。
J. 我所测定的蛋白分子量是 105 kDa，按理说分离胶应当采用 7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用 11％ 的配方，不知为何？
解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为 105 kDa 的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
K. 接下来我准备采用 DAB 显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用 5％ 的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用 BSA 代替应该好一点。
L. 一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：Western Blot 一般上样 30~100 微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳 性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合 Western Blot 的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
M. 做组织样品的 western 的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比 BSA 好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入 ＰＭＳＦ 和蛋白酶抑制剂 cocktail），封闭剂一般 5% 脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用 BSA 也是不错的选择。
N. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白 200 kDa，在做 western 要注意什么呢？
解答：做 200 kDa 蛋白的 Western Blot 时要注意，分离胶最好选择 7% 的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
O. 有什么方法可以提高上样量？
解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
P. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为 42 kDa 的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42 kDa 的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用 RIPAbuffer 提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做 Western Blot 就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42 kDa 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
Q. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的 Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了， 但是不要超过 0.3 μg/mm2。
R. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
S. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子 Western Blot，其二抗有何要求？
解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用 HRP 标记的二抗。
T. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的 ELL+plus 试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短 Western Blot 时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般 37 ℃，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗 1:1 500；二抗 1:20 000 试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是 5 × 5 min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！
U. 免疫组化和 Western Blot 可以用同一种抗体吗？
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）
V. Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用 2~3 次。稀释后应在 2~3 天内使用，4 ℃ 保存，避免反复冻融。来源：丁香实验预览相关方法底物化学发光 ECL 法2023-07-14wb实验中，小分子蛋白跑不出来的原因及对策？2023-06-08western blot 问题条带的原因？附解决办法2023-06-05相关问答问做WB用预置胶跑maker条带很挤3 回答 501 围观2022-04-06问小分子蛋白（10KD）WB实验电泳液中不加SDS，但是wb不就是依靠SDS聚丙烯凝胶电泳的吗？如果不加SDS，是用tris填平吗5 回答 347 围观2024-02-06问请问有没有会取小鼠背根神经节的大佬！求指导，求发视频啊2024-03-09推荐阅读Western Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答)Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western Blot详解－原理提问48 小时有问必答扫一扫实验小助手关注公众号反馈TOP打开